Este método descreve uma técnica para estudar a remodelação da membrana durante a migração de neutrófilos no animal vivo usando microscopia subcelular intravital. Este protocolo fornece uma abordagem única para estudar a dinâmica da membrana durante a migração animal sob condição física e para não envolver o microambiente tecidual. Esta técnica pode ser adaptada para abordar a remodelação da membrana e o reposicionamento dinâmico de órgãos do citoesqueleto e o tráfego de membrana em diferentes tipos de células e células migratórias.
Para começar, adicione o corante fluorescente verde à suspensão de neutrófilos, purificada do camundongo selvagem em 1,5 mililitros de tubo revestido com BSA. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente sob agitação suave num rotador de tubos. Dê três lavagens usando HBSS, seguidas de centrifugação a 400 vezes G em temperatura ambiente por cinco minutos e ressuspensão do pellet em um mililitro de solução salina balanceada de Hanks.
Coloque esta suspensão no tubo revestido com BSA em um rotador de tubo sob agitação suave até o procedimento de injeção. Antes da injeção, ressuspenda o pellet celular em solução salina para atingir uma densidade de 2 milhões a 5 milhões de células por 20 microlitros. Transfira o animal anestesiado para uma almofada de aquecimento com 37 graus Celsius para manter a temperatura corporal.
Depois de testar o reflexo de retirada da pata, remova os pelos da orelha usando um aparador fino para otimizar a qualidade da imagem. Coloque o animal de lado, segure a borda da orelha e alise-a ao longo da almofada de aquecimento usando a fita cirúrgica, depois encha uma seringa equipada com uma agulha de calibre 33 com a suspensão de neutrófilos e monte-a em um micromanipulador. Mova suavemente a agulha em direção à orelha e perfure lentamente a pele.
Assim que a agulha estiver dentro da pele, empurre lentamente o pistão e forneça de dois a três microlitros de suspensão celular. Depois de repetir cuidadosamente a injeção em duas a três áreas diferentes da orelha, remova cuidadosamente a fita cirúrgica e deixe o animal recuperar a consciência sob supervisão. Deixe o animal descansar por uma hora antes da imagem para permitir que o tecido e as células se recuperem do procedimento de injeção.
Certifique-se de que o microscópio esteja ligado e que a platina e as lentes sejam pré-aquecidas a 37 graus Celsius antes de colocar o animal anestesiado na platina do microscópio. Cubra o buraco no palco com uma lamínula de vidro. Mova o animal anestesiado para o palco com cuidado.
Se a imagem for planejada para mais de uma hora, aplique a pomada oftálmica e proteja o sistema de perfusão baseado em infusão alada. Coloque uma gota de solução salina no centro da lamínula e coloque a orelha injetada de neutrófilos em cima dela. Alise suavemente a orelha usando um cotonete estéril no centro da lamínula para remover bolsas de ar.
Prenda a orelha pressionando suavemente uma vara de madeira na lateral da orelha mais perto da cabeça do animal e prendendo-a com fita adesiva. Em seguida, encontre uma área de interesse usando a ocular do microscópio e mude para o modo de aquisição de vários fótons. Defina o comprimento de onda de excitação do laser para 900 a 930 nanômetros para permitir a aquisição simultânea de corante fluorescente verde, mTomato e colágeno-I.
Em seguida, defina o conjunto apropriado de espelhos e combinações de filtros nos detectores para coletar a luz emitida. Determine a configuração mais apropriada para a configuração de hardware. Mesmo que as células migratórias possam ser rastreadas com intervalos de 30 segundos a um minuto, a imagem de eventos subcelulares com uma velocidade maior de pelo menos menos dez segundos em intervalos.
Na abordagem clássica de microscopia intravital, use uma lente de 30X e um scanner Galvo com um tamanho de imagem de 512 por 512 pixels para rastrear a migração celular e investigar o tecido do camundongo hospedeiro e defina o deslocamento do eixo Z usando o estágio motorizado com um tamanho de passo de dois micrômetros para permitir a imagem de um volume de 30 micrômetros de profundidade a cada 30 segundos. Na abordagem de microscopia subcelular intravital, use uma lente de 40X e um scanner de ressonância com média de três vezes para obter imagens da remodelação da membrana altamente dinâmica com maior ampliação e resolução. Defina também o deslocamento do eixo Z usando um piezo com um tamanho de passo de um micrômetro, permitindo imagens de volume de 20 micrômetros de profundidade a cada quatro a cinco segundos.
Induza uma lesão por laser estéril para desencadear a migração de neutrófilos, focalizando um laser de excitação de alta potência em uma área estreita de 20 por 20 micrômetros por 10 segundos. Identifique a lesão induzida por laser por seus fortes sinais autofluorescentes que aparecem em todos os canais e pela alteração resultante do arranjo de colágeno. Salve os dados no final da experimentação para análises posteriores.
O camundongo receptor permitiu visualizar características estruturais no tecido da orelha, como vasos sanguíneos, células residentes e folículos pilosos por meio de uma abordagem baseada em microscopia intravital. As lesões induzidas pelo laser foram facilmente visualizadas devido à sua forte autofluorescência detectada em todos os canais e pelas alterações do arranjo de colágeno. Uma visão completa da arquitetura tridimensional da pele e a localização dos neutrófilos injetados retratam uma pilha Z da pele das camadas externa para interna EM uma renderização de volume tridimensional.
A imagem de lapso de tempo mostrou os neutrófilos coletando amostras da pele da orelha e interagindo com a matriz intracelular e o tecido hospedeiro. Usando a microscopia subcelular intravital, a remodelação dinâmica da membrana plasmática durante a migração, a formação de saliências da membrana na borda de ataque e a retração da parte traseira das células são claramente visualizadas. As sequências de lapso de tempo revelam a complexidade das interações com a matriz intracelular.
A dinâmica local da membrana plasmática foi analisada usando um pipeline de algoritmo baseado na identificação de 100 pontos de contorno subjacentes à superfície celular. As mudanças na curvatura local e na área sublinhada pelas saliências da membrana plasmática foram calculadas para cada ponto de contorno e relatadas para cada período de tempo como quimógrafos. Tanto a frente quanto a parte de trás das células mantêm uma curvatura mais alta do que a lateral das células.
As mudanças negativas na área são mais aparentes na parte de trás das células do que na borda de ataque, onde as mudanças positivas na área são mais proeminentes. Após a imagem, o tecido pode ser coletado, fixado e processado para coloração para avaliar melhor o alvo de interesse e elucidar os mecanismos. Este procedimento projetado para obter imagens da dinâmica da membrana pode ser adaptado para abordar questões mais amplas de biologia celular em diferentes tipos de células e células migratórias em seus respectivos ambientes.
