שיטה זו מתארת טכניקה לחקר עיצוב מחדש של קרום במהלך נדידת נויטרופילים בחיה חיה באמצעות מיקרוסקופיה תת-תאית תוך-תאית. פרוטוקול זה מספק גישה ייחודית לחקר הדינמיקה של הממברנות במהלך נדידת בעלי חיים בתנאים פיזיים, ולביטול המיקרו-סביבה של הרקמות. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת כדי לטפל בעיצוב מחדש של הממברנות ומיקום מחדש של איברים דינמיים של שלד ציטו-שלד וסחר בקרום בסוגי תאים שונים ובתאים נודדים.
כדי להתחיל, הוסף את הצבע הפלואורסצנטי הירוק לתרחיף הנויטרופילים, מטוהר מעכבר מסוג פרא ב -1.5 מיליליטר של צינור מצופה BSA. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה במסובב צינור. יש לבצע שלוש שטיפות באמצעות HBSS, ולאחר מכן לבצע צנטריפוגה בטמפרטורה של 400 כפול G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, ולהשהות מחדש את הגלולה בתמיסת מלח מאוזנת של מיליליטר אחד.
הניחו את המתלה הזה בצינור המצופה BSA במסובב צינור תחת תסיסה עדינה עד להליך ההזרקה. לפני ההזרקה, להשהות מחדש את גלולת התא בתמיסת מלח כדי להגיע לצפיפות של 2 מיליון עד 5 מיליון תאים לכל 20 מיקרוליטר. העבירו את בעל החיים המורדם לכרית חימום בעלת 37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על טמפרטורת גופו.
לאחר בדיקת רפלקס משיכת הכפות, הסירו את השערות מהאוזן באמצעות גוזם עדין כדי למטב את איכות התמונה. הניחו את בעל החיים על צדו, החזיקו את קצה האוזן ושטחו אותו לאורך כרית החימום באמצעות סרט הניתוח, ואז מלאו מזרק מצויד במחט מד 33 עם מתלה נויטרופילים והרכיבו אותו על מיקרומניפולטור. הזיזו בעדינות את המחט לכיוון האוזן, ולאט לאט ניקבו את העור.
ברגע שהמחט נמצאת בתוך העור, דחפו לאט את הבוכנה, וספקו שניים עד שלושה מיקרוליטרים של השעיית תאים. לאחר חזרה זהירה על ההזרקה עבור שניים עד שלושה אזורים שונים של האוזן, בזהירות להסיר את סרט הניתוח, ולתת לחיה לחזור להכרה תחת השגחה. אפשרו לבעל החיים לנוח שעה לפני ההדמיה כדי לאפשר לרקמה ולתאים להתאושש מהליך ההזרקה.
ודאו שהמיקרוסקופ מופעל, והבמה והעדשות מחוממות מראש ל-37 מעלות צלזיוס לפני שאתם מניחים את בעל החיים המרדים על במת המיקרוסקופ. כסו את החור בבמה בכיסוי זכוכית. העבירו את בעל החיים המרדים אל הבמה בזהירות.
אם ההדמיה מתוכננת ליותר משעה, יש למרוח את משחת העיניים ולאבטח את מערכת הזילוח המבוססת על עירוי מכונף. מניחים טיפת מלח על מרכז הכיסוי, ומניחים עליה את האוזן המוזרקת של הנויטרופילים. שטחו בעדינות את האוזן באמצעות צמר גפן סטרילי לאורך מרכז הכיסוי כדי להסיר כיסי אוויר.
אבטחו את האוזן על ידי לחיצה עדינה של מקל עץ לצד האוזן קרוב יותר לראשו של בעל החיים, ונעילתו באמצעות נייר דבק. לאחר מכן מצאו אזור עניין באמצעות עינית המיקרוסקופ, ועברו למצב רכישת פוטונים מרובים. הגדר את אורך גל עירור הלייזר ל- 900 עד 930 ננומטר כדי לאפשר רכישה בו זמנית של צבע פלואורסצנטי ירוק, mTomato וקולגן-I.
לאחר מכן הגדר את סט המראות ושילובי המסננים המתאימים על הגלאים כדי לאסוף את האור הנפלט. קבע את ההגדרה המתאימה ביותר לתצורת החומרה. גם אם ניתן לעקוב אחר תאים נודדים במרווחים של 30 שניות עד דקה, תמונה של אירועים תת-תאיים במהירות גבוהה יותר של מרווחים של פחות מעשר שניות לפחות.
בגישת המיקרוסקופ התוך-חיוני הקלאסית, השתמשו בעדשת 30X ובסורק Galvo בגודל תמונה של 512 על 512 פיקסלים כדי לעקוב אחר נדידת התאים ולחקור את רקמת העכבר המארח, וקבעו את תזוזת ציר Z באמצעות השלב הממונע עם גודל צעד של שני מיקרומטרים כדי לאפשר הדמיה של נפח עומק של 30 מיקרומטר כל 30 שניות. בגישת המיקרוסקופ התת-תאי התוך-תאי, השתמש בעדשת 40X ובסורק תהודה עם ממוצע של פי שלושה כדי לצלם את עיצוב מחדש של הממברנה הדינמית ביותר בהגדלה וברזולוציה גבוהות יותר. כמו כן, הגדר תזוזה של ציר Z באמצעות piezo בגודל צעד של מיקרומטר אחד, המאפשר הדמיה בנפח עמוק של 20 מיקרומטר כל ארבע עד חמש שניות.
לגרום לפגיעת לייזר סטרילית כדי לעורר את נדידת הנויטרופילים על ידי מיקוד לייזר עירור בעוצמה גבוהה על שטח צר של 20 על 20 מיקרומטר למשך 10 שניות. זהה פגיעה הנגרמת על ידי לייזר על ידי אותות אוטופלואורסצנטיים חזקים המופיעים בכל הערוצים, ועל ידי שינוי כתוצאה מכך של סידור קולגן. שמור את הנתונים בסוף הניסוי לניתוחים נוספים.
העכבר המושתל איפשר הדמיה של תכונות מבניות ברקמת האוזן כגון כלי דם, תאים תושבים, וזקיקי שיער באמצעות גישה מבוססת מיקרוסקופ תוך חיוני. הפציעות המושרות בלייזר הודמו בקלות בשל האוטופלואורסצנטיות החזקה שלהן שזוהתה בכל הערוצים, ועל ידי השינויים בסידור הקולגן. מבט מלא על הארכיטקטורה התלת-ממדית של העור והלוקליזציה של הנויטרופילים המוזרקים מתאר ערימת Z של העור מהשכבה החיצונית לשכבה הפנימית בעיבוד נפח תלת ממדי.
הדמיה בהילוך מהיר הראתה שהנויטרופילים דגמו את עור האוזן וקיימו אינטראקציה עם המטריצה התוך-תאית והרקמה המארחת. באמצעות מיקרוסקופ תת-תאי תוך תאי, עיצוב מחדש דינמי של קרום הפלזמה במהלך הנדידה, היווצרות בליטות קרום בקצה המוביל, ואת הנסיגה של החלק האחורי של התאים הם דמיינו בבירור. רצפי קיטועי הזמן חושפים את מורכבות האינטראקציות עם המטריצה התוך-תאית.
הדינמיקה המקומית של קרום הפלזמה נותחה באמצעות צינור אלגוריתם המבוסס על זיהוי של 100 נקודות גבול מתחת לפני השטח של התא. השינויים בעקמומיות המקומית והשטח המודגש על ידי בליטות קרום הפלזמה חושבו עבור כל נקודת גבול, ודווחו עבור כל מסגרת זמן כקימוגרפים. הן החלק הקדמי והן החלק האחורי של התאים שומרים על עקמומיות גבוהה יותר מאשר הצד של התאים.
שינויים שליליים באזור ניכרים יותר בחלק האחורי של התאים מאשר בקצה המוביל, שם שינויי האזור החיובי בולטים יותר. לאחר ההדמיה, ניתן לאסוף, לתקן ולעבד רקמות לצביעה כדי להעריך עוד יותר את היעד של העניין ולהבהיר מנגנונים. הליך זה, שנועד לדמות דינמיקה של ממברנה, יכול להיות מותאם כדי לענות על שאלות ביולוגיה רחבות יותר של התא בסוגי תאים שונים ובתאים נודדים בסביבתם.
