Questo metodo descrive una tecnica per studiare il rimodellamento della membrana durante la migrazione dei neutrofili nell'animale vivo utilizzando la microscopia subcellulare intravitale. Questo protocollo fornisce un approccio unico per studiare la dinamica della membrana durante la migrazione animale in condizioni fisiche e per non coinvolgere il microambiente tissutale. Questa tecnica può essere personalizzata per affrontare il rimodellamento della membrana e il riposizionamento dinamico degli organi del citoscheletro e il traffico di membrana in diversi tipi di cellule e cellule migratorie.
Per iniziare, aggiungere il colorante fluorescente verde alla sospensione neutrofila, purificato dal topo wild-type in 1,5 millilitri di tubo rivestito di BSA. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente in un rotatore di provette. Somministrare tre lavaggi con HBSS, seguiti da centrifugazione a 400 volte G a temperatura ambiente per cinque minuti e risospendere il pellet in un millilitro di soluzione salina bilanciata di Hanks.
Posizionare questa sospensione nel tubo rivestito di BSA in un rotatore di tubi agitando delicatamente fino alla procedura di iniezione. Prima dell'iniezione, risospendere il pellet cellulare in soluzione salina per raggiungere una densità compresa tra 2 milioni e 5 milioni di cellule per 20 microlitri. Trasferisci l'animale anestetizzato su un cuscinetto riscaldante a 37 gradi Celsius per mantenere la sua temperatura corporea.
Dopo aver testato il riflesso di ritiro della zampa, rimuovere i peli dall'orecchio utilizzando un rifinitore fine per ottimizzare la qualità dell'immagine. Posizionare l'animale su un fianco, tenere il bordo dell'orecchio e appiattirlo lungo il cuscinetto riscaldante utilizzando il nastro chirurgico, quindi riempire una siringa dotata di ago calibro 33 con la sospensione di neutrofili e montarla su un micromanipolatore. Muovi delicatamente l'ago verso l'orecchio e perfora lentamente la pelle.
Una volta che l'ago è all'interno della pelle, spingere lentamente il pistone ed erogare due o tre microlitri di sospensione cellulare. Dopo aver ripetuto attentamente l'iniezione per due o tre diverse aree dell'orecchio, rimuovere con cura il nastro chirurgico e lasciare che l'animale riprenda conoscenza sotto supervisione. Lasciare riposare l'animale per un'ora prima dell'imaging per consentire al tessuto e alle cellule di riprendersi dalla procedura di iniezione.
Assicurarsi che il microscopio sia acceso e che il tavolino e le lenti siano preriscaldati a 37 gradi Celsius prima di posizionare l'animale anestetizzato sul tavolino del microscopio. Copri il foro nel palco con un vetrino coprioggetti. Spostare con cautela l'animale anestetizzato sul tavolino.
Se l'imaging è pianificato per più di un'ora, applicare l'unguento oftalmico e fissare il sistema di perfusione alato basato sull'infusione. Posizionare una goccia di soluzione salina al centro del vetrino coprioggetti e posizionare sopra di esso l'orecchio iniettato con neutrofili. Appiattire delicatamente l'orecchio utilizzando un batuffolo di cotone sterile al centro del vetrino coprioggetti per rimuovere le sacche d'aria.
Fissa l'orecchio premendo delicatamente un bastoncino di legno sul lato dell'orecchio più vicino alla testa dell'animale e bloccandolo con del nastro adesivo. Quindi trova un'area di interesse utilizzando l'oculare del microscopio e passa alla modalità di acquisizione multi-fotone. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione del laser da 900 a 930 nanometri per consentire l'acquisizione simultanea di colorante fluorescente verde, mTomato e collagene-I.
Quindi impostare il set appropriato di specchi e combinazioni di filtri sui rilevatori per raccogliere la luce emessa. Determinare l'impostazione più appropriata per la configurazione hardware. Anche se le cellule in migrazione possono essere tracciate con intervalli da 30 secondi a un minuto, l'imaging degli eventi subcellulari con una velocità maggiore di almeno meno di dieci secondi.
Nell'approccio classico della microscopia intravitale, utilizzare una lente 30X e uno scanner Galvo con una dimensione dell'immagine di 512 x 512 pixel per tracciare la migrazione cellulare e studiare il tessuto del topo ospite, e impostare lo spostamento dell'asse Z utilizzando il tavolino motorizzato con una dimensione del passo di due micrometri per consentire l'imaging di un volume profondo 30 micrometri ogni 30 secondi. Nell'approccio di microscopia subcellulare intravitale, utilizzare una lente 40X e uno scanner di risonanza con media tre volte per visualizzare il rimodellamento della membrana altamente dinamico a un ingrandimento e una risoluzione più elevati. È inoltre possibile impostare lo spostamento dell'asse Z utilizzando un piezo con una dimensione del passo di un micrometro, consentendo l'imaging di volumi profondi 20 micrometri ogni quattro o cinque secondi.
Indurre una lesione laser sterile per innescare la migrazione dei neutrofili focalizzando un laser di eccitazione ad alta potenza su un'area ristretta di 20 per 20 micrometri per 10 secondi. Identificare le lesioni indotte dal laser dai suoi forti segnali autofluorescenti che appaiono in tutti i canali e dalla conseguente alterazione della disposizione del collagene. Salvare i dati al termine della sperimentazione per ulteriori analisi.
Il topo ricevente ha permesso di visualizzare le caratteristiche strutturali del tessuto dell'orecchio come i vasi sanguigni, le cellule residenti e i follicoli piliferi tramite un approccio basato sulla microscopia intravitale. Le lesioni indotte dal laser sono state facilmente visualizzate grazie alla loro forte autofluorescenza rilevata in tutti i canali e alle alterazioni della disposizione del collagene. Una visione completa dell'architettura tridimensionale della pelle e della localizzazione dei neutrofili iniettati ritrae una pila Z della pelle dagli strati esterni a quelli interni IN una resa tridimensionale del volume.
L'imaging time-lapse ha mostrato che i neutrofili campionavano la pelle dell'orecchio e interagivano con la matrice intracellulare e il tessuto ospite. Utilizzando la microscopia subcellulare intravitale, vengono chiaramente visualizzati il rimodellamento dinamico della membrana plasmatica durante la migrazione, la formazione di sporgenze di membrana sul bordo anteriore e la retrazione della parte posteriore delle cellule. Le sequenze time-lapse rivelano la complessità delle interazioni con la matrice intracellulare.
La dinamica locale della membrana plasmatica è stata analizzata utilizzando un algoritmo basato sull'identificazione di 100 punti di confine sottostanti la superficie cellulare. Le variazioni della curvatura locale e dell'area sottolineata dalle sporgenze della membrana plasmatica sono state calcolate per ogni punto di confine e riportate per ogni intervallo di tempo come chimografi. Sia la parte anteriore che quella posteriore delle celle mantengono una curvatura maggiore rispetto al lato delle celle.
Le variazioni negative dell'area sono più evidenti nella parte posteriore delle celle rispetto al bordo anteriore, dove le variazioni positive dell'area sono più evidenti. Dopo l'imaging, il tessuto può essere raccolto, fissato e processato per la colorazione per valutare ulteriormente il bersaglio di interesse e chiarire i meccanismi. Questa procedura progettata per l'imaging della dinamica della membrana può essere adattata per affrontare una questione più ampia di biologia cellulare in diversi tipi di cellule e cellule in migrazione nei rispettivi ambienti.
