В настоящее время нет полного излечения рассеянного склероза. Наш протокол позволяет эффективно построить экспериментальную модель аутоиммунного энцефаломиелита, чтобы помочь изучить методы лечения рассеянного склероза. Основным преимуществом нашего протокола является более комплексная оценка лечения экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита с разных точек зрения.
Сначала готовят миелин олигодендроцитарную гликопротеиновую пептидную эмульсию путем растворения лиофилизированного пептида и стерильного предварительно охлажденного PBS без ионов кальция и магния при рН 7,4. Добавьте один стерилизованный пятимиллиметровый стальной шарик в чистую двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку. Затем добавьте в трубку 500 микролитров полного адъюванта Фрейда, содержащего пять миллиграммов на миллилитр лиофилизированной микробактерии туберкулеза и 500 микролитров миелиновой олигодендроцитарной гликопротеиновой пептидной эмульсии.
Теперь осциллируйте трубку на тканевом лизере в течение 10 минут. Затем охладить тюбики на льду в течение 10 минут. Повторяйте процесс четыре раза, пока не образуется белый вязкий раствор.
Далее разводят раствор стебля коклюшного токсина 50 раз в стерильном PBS рН 7,4 без ионов кальция и магния для достижения конечной концентрации 200 нанограмм на 100 микролитров. Чтобы высадить всю первоначально приготовленную миелиновую олигодендроцитарную гликопротеиновую пептидную эмульсию в нижней части трубки, центрифугируют трубку при четырех градусах Цельсия в течение двух-трех секунд, нажав кнопку импульса на оборудовании. Аспирируйте миелиновую олигодендроцитарную гликопротеиновую пептидную эмульсию с помощью одного миллилитра шприца, оснащенного иглой 22 калибра, и перенесите эмульсию в новый 1-миллилитровый шприц-бочку.
Прикрепите к стволу иглу 26 калибра и закрепите соединение уплотнительной пленкой. Вводят 100 микролитров миелиновой олигодендроцитарной гликопротеиновой пептидной эмульсии подкожно с каждой стороны спинного отдела позвоночника мыши. После инъекции наблюдают автоматическое образование луковичных масс под кожей и спинкой.
Затем внутрибрюшинно вводят 100 микролитров коклюшного токсина той же мыши. Подготовьте реакционную камеру открытого поля и настройте систему видеоанализа для записи передвижения мыши. Чтобы очистить реакционную камеру перед экспериментом, распылите 70% этанола на всю площадь и протрите чистым бумажным полотенцем.
Затем поместите мышь в угол реакционной камеры. Чтобы начать съемку, нажмите на кнопку начать захват в строке меню системы видеозаписи и запишите время. Сохраняя тишину в тестовой комнате, дайте мыши свободно двигаться в течение пяти минут.
Затем остановите запись и сохраните видео. Поместите мышь обратно в клетку. Затем очистите испытуемую область 70% этанолом и приступайте к следующей мыши.
Держите усыпленную мышь плоско на рассекающем лотке и зафиксируйте конечности. Подержите кожу задних конечностей в мыши щипцами и откройте кожу и мышцы ножницами. Затем отделите бедренную кость от большеберцовой кости и тазобедренной кости, осторожно используя ножницы.
Удалите ножницами мышцы, прилипшие к бедренной кости. Затем поместите бедренную кость в 70% этанол при комнатной температуре. В этом исследовании оценивалась способность пептида миелина олигодендроцитов, полученного из гликопротеина, индуцировать EAE.
Мыши, которым вводили пептид, испытывали прогрессирующую потерю веса. После шести-девяти дней инъекции у них развились симптомы EAE, которые достигли пика через 14-16 дней. Графики треков из теста в открытом поле показали, что EAE изменяет нормальное исследовательское поведение мышей.
По сравнению с обычными мышами, мыши с EAE прошли значительно меньшее расстояние в фазах раннего начала, пика и ремиссии. Мыши с EAE также имели значительно сниженную продолжительность активности в фазах пика и ремиссии заболевания. Более того, во всех трех фазах мыши EAE имели значительно меньшее расстояние перемещения и времени, проведенного в центре.
Микрокомпьютерная томография бедренных костей у мышей EAE выявила трабекулярную архитектуру, отличную от нормальных мышей. Бедренные кости у мышей EAE имели значительно меньшую минеральную плотность кости и отношение объема кости к объему ткани, чем у нормальных мышей. Кроме того, бедренные кости у мышей с EAE имели меньшую плотность трабекулярного соединения, трабекулярное число и толщину трабекуляра, чем у нормальных мышей.
По сравнению с нормальными мышами, трабекулярное расстояние было увеличено, а толщина кортикальной кости была уменьшена у мышей EAE. Мы также можем выделить мозговой и спинной код мышей EAE на пике заболевания и проанализировать выработку иммунных клеток и цитокинов с помощью цитометрии гриппа.
