PCLS поддерживает оценку активности гладкомышечных клеток дыхательных путей и сосудов в почти неповрежденной тканевой среде, тем самым обеспечивая бесценную модель ex vivo для легочных исследований. С точки зрения исследования гладкой мускулатуры, прецизионные срезы легких сохраняют фенотип гладкомышечных клеток in vivo и их взаимодействие с окружающими структурами, обеспечивая доступ к гладкомышечным клеткам, что важно для механистического исследования на клеточном уровне. Для начала поместите тело мыши на рассеченную доску в лежачем положении.
Зажмите хвост, передние лапы и голову шприцевыми иглами 25G и продезинфицируйте тело 70% этанолом. Осторожно откройте грудную полость вдоль грудины и двусторонней нижней грудной клетки над диафрагмой. Затем направьте острый кончик ножниц в сторону от легочной ткани и удалите часть двусторонних вентральных грудных клеток, чтобы обнажить сердце.
Обратите внимание, что доли легких разрушаются при открытии грудной полости. Используйте ножницы для удаления мягких тканей в шее мыши, чтобы обнажить трахею. На верхнем конце трахеи делают небольшое отверстие диаметром 1,2 миллиметра, которое должно позволить прохождение 20G Y-образного IV катетера наконечника.
Соедините один порт адаптера Y-образного катетера с 3-миллилитровым шприцем, предварительно заполненным 0,5 миллилитрами воздуха, а другой порт 3-миллилитровым шприцем, предварительно заполненным 2 миллилитрами 1,5% раствора агарозы, нагретого до 42 градусов Цельсия. Введите раствор агарозы для заполнения катетера, а затем протолкните катетер через отверстие в трахею на 5-8 миллиметров. Медленно вводят раствор агарозы со скоростью 1 миллилитр в 5 секунд.
Обратите внимание, что легкое расширяется вдоль проксимальной до дистальной оси. Прекратите инъекцию, когда край каждой доли легкого раздут. Затем введите от 0,2 до 0,3 миллилитра воздуха из другого шприца, чтобы протолкнуть остаточную агарозу в проводящие дыхательные пути в дистальное пространство альвеол.
Клипс закрыл трахею парой изогнутых гемостатических щипцов. Чтобы заполнить легочную сосудистую систему, заполните шприц объемом 1 миллилитр теплым 6% желатином и подключите его к катетеру вен головы иглой. Наполните катетер раствором желатина, а затем проколите иглой правый желудочек близко к нижней стенке.
Протолкните иглу на 2-3 миллиметра в правый желудочек и направьте кончик иглы на главную легочную артерию. Медленно вводят примерно 0,2 миллилитра раствора желатина в правый желудочек и легочные артериальные сосуды. Держите иглу на месте в течение пяти минут после инъекции и охладите доли легких, вылив ледяной холодный раствор HBSS на сердце и легкое и поместите тело в холодильник.
После этого шага удалите ножницами легкое и сердце мыши из окружающих соединительных тканей. Затем отделите каждую долю легкого и держите их в растворе HBSS на льду. Обрежьте долю легкого и сориентируйте ее так, чтобы направление разреза было перпендикулярно большинству дыхательных путей от хилы до поверхности легкого.
Прикрепите его поверх колонны образца суперклеем. Используйте вибратом со свежим тонким лезвием бритвы, чтобы разрезать долю легкого на 150-микрометровые срезы. Соберите ломтики в стерильные чашки Петри, предварительно заполненные холодным раствором HBSS.
Переложите ломтики в чашки Петри, наполненные питательной средой DMEM/F-12. Поместите посуду в инкубатор с температурой 37 градусов цельсия на ночь перед экспериментами. Поместите один прецизионно разрезанный ломтик легкого в каждую лунку из 24-луночной культуральной пластины, заполненной HBSS.
Найдите ломтик в середине лунки, а затем удалите раствор HBSS пипеткой. Под микроскопом найдите целевые дыхательные пути и сосуд в срезе, а затем накройте его с помощью нейлоновой сетки с предварительно вырезанным центральным отверстием, чтобы обнажить целевую область воздушного судна. Положите полую металлическую шайбу поверх сетки, чтобы удерживать ломтики на месте.
Затем добавьте 600 микролитров раствора HBSS, чтобы погрузить ломтики. Через 10 минут запишите базовые изображения. Чтобы вызвать сокращение дыхательных путей или сосудов, осторожно удалите раствор HBSS пипеткой и добавьте 600 микролитров HBSS с агонистом.
Чтобы подготовить буфер загрузки кальциевого красителя, сначала растворите 50 мкг красителя с 10 микролитрами DMSO и 0,2 граммами порошка Pluronic F-12 в 1 миллилитре DMSO. Смешайте 10 микролитров раствора Pluronic с 10 микролитрами раствора красителя кальция. Добавьте эту смесь к 2 миллилитрам раствора HBSS, содержащего 200 микромоляров сульфобромофталеина.
Затем поместите 15 прецизионных срезов легких в 2 миллилитра буфера нагрузки кальция и инкубируйте при 30 градусах Цельсия в течение одного часа, а затем инкубируйте в HBSS, содержащем 100 микромолярного сульфобромофталеина, в течение 30 минут. Затем поместите нагруженные кальциевым красителем ломтики на большой покровный стакан. Заполните высоковакуумную силиконовую смазку в шприц объемом 3 миллилитра, прикрепленный к тупой игле 18G или наконечнику пипетки объемом 200 микролитра, и проведите две параллельные линии по всему покровному стеклу, выше и ниже среза.
Накройте срез нейлоновой сеткой между двумя линиями смазки. Поместите второе покровное стекло поверх сетки, чтобы создать камеру. Добавьте HBSS или раствор агониста в камеру с одного конца пипеткой.
Удалите жидкость из камеры, всасывая с другого конца папиросную бумагу. Камера среза теперь готова к визуализации кальция с помощью высокоскоростного лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Пучки артерий легочных дыхательных путей наблюдались в прецизионно разрезанных срезах легких толщиной 150 микрометров под фазоконтрастным микроскопом.
В состоянии покоя дыхательные пути были идентифицированы кубоидальными эпителиальными клетками с близлежащей легочной артерией. После воздействия метахолина просветная область была уменьшена, в то время как легочная артерия не показала никакой реакции на раздражители. Сократительные реакции дыхательных путей были количественно определены процентом уменьшения площади просвета и показали аналогичные дозозависимые ответы в однодневных и пятидневных культурах.
Достигнув периферического поля легких, проводящие дыхательные пути разветвляются в дыхательные протоки и мешочки, окружающие небольшие внутриацинарные артериолы. При воздействии эндотелия оба дыхательных пути и легочные артерии сужаются, что сопровождается индуцированной расслаблением NOC-5. В состоянии покоя нагруженные кальциевым красителем срезы показали низкую флуоресценцию в гладкомышечных клетках дыхательных путей и сосудистой системы под конфокальным флуоресцентным микроскопом.
При воздействии агонистов интенсивность флуоресценции кальция повышалась в клетках и распространялась на всю клетку, что коррелировало с колебательными сигналами. С точки зрения техники, важно раздувать легкое агарозой однородно и избегать быстрой или чрезмерной инъекции агарозы. Всегда проталкивайте воздух в конце, чтобы промыть агарозу из проводящих дыхательных путей в дистальное пространство альвеол.
Таким образом, используя культуру прецизионных срезов легких, можно обеспечить особое разнообразие функций гладкой мускулатуры легких и смоделировать дерегуляцию гладкой мускулатуры in vitro. Он также обеспечивает идеальную платформу для скрининга ново вазодилататорных или бронходилататорных препаратов.
