El PCLS apoya la evaluación de la actividad de las células del músculo liso vascular y de las vías respiratorias en un entorno tisular casi intacto, proporcionando así un modelo ex vivo invaluable para la investigación pulmonar. En términos de investigación del músculo liso, las rodajas de pulmón cortadas con precisión preservan el fenotipo in vivo de las células del músculo liso y su interacción con las estructuras circundantes, al tiempo que permiten el acceso a la célula muscular lisa, lo cual es importante para un estudio mecanicista a nivel celular. Para comenzar, coloque el cuerpo del ratón en una tabla de disección en posición supina.
Fije la cola, las patas delanteras y la cabeza con agujas de jeringa 25G y desinfecte el cuerpo con etanol al 70%. Abra la cavidad torácica con cuidado a lo largo del esternón y la caja torácica inferior bilateral por encima del diafragma. Luego, apunte la punta de la tijera afilada lejos del tejido pulmonar y retire parte de las cajas torácicas ventrales bilaterales para exponer el corazón.
Observe que los lóbulos pulmonares colapsan cuando se abre la cavidad torácica. Use tijeras para eliminar el tejido blando en el cuello del ratón para exponer la tráquea. En el extremo superior de la tráquea se hace un pequeño orificio de diámetro de 1,2 milímetros que debe permitir el paso de una punta de catéter IV en forma de Y de 20G.
Conecte un puerto adaptador del catéter en forma de Y con una jeringa de 3 mililitros precargada con 0,5 mililitros de aire y el otro puerto con una jeringa de 3 mililitros precargada con 2 mililitros de solución de agarosa al 1,5% calentada a 42 grados Celsius. Inyecte solución de agarosa para llenar el catéter y luego empuje el catéter a través de la abertura hacia la tráquea a 5 a 8 milímetros. Inyecte lentamente la solución de agarosa a una velocidad de 1 mililitro por 5 segundos.
Observe que el pulmón se expande a lo largo del eje proximal a distal. Detenga la inyección cuando el borde de cada lóbulo pulmonar esté inflado. Luego, inyecte de 0.2 a 0.3 mililitros de aire de la otra jeringa para empujar la agarosa residual hacia las vías respiratorias conductoras hasta el espacio de los alvéolos distales.
Clip cerró la tráquea con un par de pinzas hemostáticas curvas. Para rellenar la vasculatura pulmonar, llene una jeringa de 1 mililitro con gelatina tibia al 6% y conéctela a un catéter de vena del cuero cabelludo con aguja. Llene el catéter con solución de gelatina y luego perfore el ventrículo derecho cerca de la pared inferior con la aguja.
Empuje la aguja durante 2 a 3 milímetros en el ventrículo derecho y apunte la punta de la aguja a la arteria pulmonar principal. Inyecte aproximadamente 0,2 mililitros de solución de gelatina lentamente en el ventrículo derecho y los vasos arteriales pulmonares. Mantenga la aguja en su lugar durante cinco minutos después de la inyección y enfríe los lóbulos pulmonares vertiendo solución de HBSS helada sobre el corazón y el pulmón y coloque el cuerpo en un refrigerador.
Después de este paso, retire el pulmón y el corazón del ratón de los tejidos conectivos circundantes con tijeras. Luego, separe cada lóbulo pulmonar y manténgalos en solución HBSS en hielo. Recorte el lóbulo pulmonar y oriente de tal manera que la dirección de corte sea perpendicular a la mayoría de las vías respiratorias desde la hila hasta la superficie pulmonar.
Colóquelo en la parte superior de la columna de muestra con súper pegamento. Use un vibratome con una cuchilla de afeitar fina y fresca para cortar el lóbulo pulmonar en rodajas de 150 micrómetros. Recoger las rodajas en placas de Petri estériles prellenadas con solución fría de HBSS.
Transfiera las rodajas a placas de Petri rellenas con medio de cultivo DMEM/F-12. Coloque los platos en una incubadora de 37 grados centígrados durante la noche antes de los experimentos. Coloque una sola rebanada de pulmón cortada con precisión en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos llena de HBSS.
Ubique la rebanada en el centro del pozo y luego retire la solución HBSS con una pipeta. Bajo un microscopio, encuentre la vía aérea objetivo y el vaso en la rebanada y luego cúbralo con una malla de nylon con un orificio central precortado para exponer el área del vaso de las vías respiratorias objetivo. Coloque una arandela de metal hueca en la parte superior de la malla para mantener las rodajas en su lugar.
Luego, agregue 600 microlitros de solución HBSS para sumergir las rodajas. Después de 10 minutos, grabe las imágenes de línea base. Para inducir la contracción de las vías respiratorias o vascular, retire con precaución la solución de HBSS con una pipeta y agregue 600 microlitros de HBSS con un agonista.
Para preparar el tampón de carga de colorante de calcio, primero disuelva 50 microgramos de tinte con 10 microlitros de DMSO y 0,2 gramos de polvo Pluronic F-12 en 1 mililitro de DMSO. Mezclar 10 microlitros de la solución Plurónica con 10 microlitros de solución de colorante de calcio. Agregue esta mezcla a 2 mililitros de solución de HBSS que contenga 200 micromolares de sulfobromoftaleína.
Luego, coloque 15 rodajas de pulmón cortadas con precisión en 2 mililitros de tampón de carga de calcio e incube a 30 grados Celsius durante una hora, seguido de incubar en HBSS que contenga 100 sulfobromoftaleína micromolar durante 30 minutos. Luego, coloque las rodajas cargadas de colorante de calcio en un vaso de cubierta grande. Llene la grasa de silicona de alto vacío en una jeringa de 3 mililitros conectada a una aguja roma de 18G o a una punta de pipeta de 200 microlitros y dibuje dos líneas paralelas a través del vidrio de la cubierta, por encima y por debajo de la rebanada.
Cubra la rodaja con una malla de nylon entre dos líneas de grasa. Coloque el vidrio de la segunda cubierta en la parte superior de la malla para generar una cámara. Agregue HBSS o una solución agonista en la cámara desde un extremo con una pipeta.
Retire el líquido de la cámara succionando desde el otro extremo con papel de seda. La cámara de la rebanada ahora está lista para las imágenes de calcio con un microscopio confocal de barrido láser de alta velocidad. Se observaron haces de arterias de las vías respiratorias pulmonares en rodajas pulmonares cortadas con precisión de espesor 150 micrómetros bajo un microscopio de contraste de fase.
En estado de reposo, se identificó una vía aérea por células epiteliales cuboidales con una arteria pulmonar cercana. Después de la exposición a la metacolina, el área luminal se redujo mientras que la arteria pulmonar no mostró respuesta a los estímulos. Las respuestas contráctiles de las vías respiratorias se cuantificaron por el porcentaje de reducción del área luminal y mostraron respuestas dependientes de la dosis similares en cultivos de un día y cinco días.
Al llegar al campo pulmonar periférico, las vías respiratorias conductoras se ramifican en conductos respiratorios y sacos que rodean las pequeñas arteriolas intraacinares. Cuando se expone a endothelii, tanto las vías respiratorias como las arterias pulmonares se contraen, lo que es seguido por la relajación inducida por NOC-5. En el estado de reposo, las rodajas cargadas de colorante de calcio mostraron baja fluorescencia en las células del músculo liso de las vías respiratorias y el sistema vascular bajo un microscopio fluorescente confocal.
Tras la exposición a los agonistas, la intensidad de la fluorescencia de calcio se elevó en las células y se propagó a toda la célula, lo que se correlacionó con las señales oscilatorias. En cuanto a la técnica, es esencial inflar el pulmón con agarosa de manera homogénea y evitar la inyección rápida o excesiva de agarosa. Siempre empuje el aire al final para enjuagar la agarosa desde la vía aérea conductora hasta el espacio de los alvéolos distales.
En resumen, utilizando el cultivo de cortes de pulmón cortados con precisión, se puede proporcionar una variedad especial de funciones del músculo liso pulmonar y modelar la desregulación del músculo liso in vitro. También proporciona una plataforma ideal para detectar medicamentos vasodilatadores o broncodilatadores novo.
