ה- PCLS תומך בהערכת פעילות תאי השריר החלקים של דרכי הנשימה וכלי הדם בסביבה של רקמה כמעט שלמה, ובכך מספק מודל ex vivo שלא יסולא בפז למחקר ריאתי. במונחים של מחקר שרירים חלקים, פרוסות הריאה החתוכות באופן מדויק משמרות את הפנוטיפ in vivo של תאי שריר חלקים ואת האינטראקציה שלהם עם המבנים הסובבים אותם, תוך מתן גישה לתאי שריר חלקים, החשובים למחקר מכניסטי ברמה התאית. כדי להתחיל, להניח את גוף העכבר על לוח דיסקציה במצב שכיבה.
הצמידו את הזנב, כפות הרגליים הקדמיות והראש עם מחטי מזרק 25G וחיטוי הגוף עם 70% אתנול. פתחו את חלל החזה בזהירות לאורך עצם החזה וכלוב הצלעות התחתון הדו-צדדי מעל הסרעפת. לאחר מכן, כוון את קצה המספריים החד הרחק מרקמת הריאה והסר חלק מכלובי הצלעות הגחוניות הדו-צדדיות כדי לחשוף את הלב.
שימו לב שאונות הריאה קורסות כאשר חלל החזה נפתח. השתמש במספריים כדי להסיר רקמות רכות בצוואר העכבר כדי לחשוף את קנה הנשימה. בקצה העליון של קנה הנשימה יוצרים חור קטן בקוטר 1.2 מילימטרים שאמור לאפשר מעבר של קצה צנתר IV בצורת 20G Y.
חברו יציאת מתאם אחת של הצנתר בצורת Y עם מזרק 3 מיליליטר ממולא מראש ב-0.5 מיליליטר אוויר והיציאה השנייה עם מזרק 3 מיליליטר הממולא מראש ב-2 מיליליטר של תמיסת אגרוז של 1.5% שחוממה ל-42 מעלות צלזיוס. הזריקו תמיסת אגרוז כדי למלא את הצנתר ולאחר מכן דחפו את הצנתר דרך הפתח לקנה הנשימה ל-5 עד 8 מילימטרים. יש להזריק באיטיות את תמיסת האגרוס בקצב של 1 מיליליטר ל-5 שניות.
שימו לב שהריאה מתרחבת לאורך הציר הפרוקסימלי עד הדיסטלי. עצרו את ההזרקה כאשר קצה כל אונת ריאות מנופח. לאחר מכן, הזריקו 0.2 עד 0.3 מיליליטרים של אוויר מהמזרק השני כדי לדחוף את האגרוז השיורי לתוך דרכי הנשימה המוליכות לחלל הנאדיות הדיסטלי.
קליפ סגר את קנה הנשימה עם זוג מלקחיים המוסטטיים מעוקלים. כדי למלא את כלי הדם הריאתיים, מלאו מזרק 1 מיליליטר בג'לטין חם של 6% וחברו אותו לצנתר וריד קרקפת מחט. ממלאים את הצנתר בתמיסת ג'לטין ואז מנקבים את החדר הימני קרוב לדופן הנחותה עם המחט.
דוחפים את המחט במשך 2 עד 3 מילימטרים לחדר הימני ומכוונים את קצה המחט לעורק הריאתי הראשי. הזריקו כ-0.2 מיליליטרים של תמיסת ג'לטין באיטיות לתוך החדר הימני וכלי העורקים הריאתיים. יש לשמור את המחט במקומה במשך חמש דקות לאחר ההזרקה ולקרר את אונות הריאה על ידי שפיכת תמיסת HBSS קר כקרח על הלב והריאות ולהניח את הגוף במקרר.
לאחר שלב זה, הסר את ריאת העכבר ואת הלב מרקמות החיבור שמסביב עם מספריים. לאחר מכן, הפרד כל אונת ריאות ושמור אותן בתמיסת HBSS על קרח. קצצו את אונת הריאה וכיוונו אותה כך שכיוון החיתוך יהיה מאונך לרוב דרכי הנשימה מההילה ועד לפני השטח של הריאה.
חברו אותו על גבי עמוד הדגימה עם דבק-על. השתמשו בוויברטום עם סכין גילוח דקה ורעננה כדי לחתוך את אונת הריאה לפרוסות של 150 מיקרומטר. אספו את הפרוסות בצלחות פטרי סטריליות הממולאות מראש בתמיסת HBSS קרה.
העבירו את הפרוסות לצלחות פטרי מלאות במדיום תרבות DMEM/F-12. מניחים את הכלים בחממה של 37 מעלות צלזיוס לילה לפני הניסויים. הניחו פרוסת ריאה אחת חתוכה במדויק בכל באר של צלחת תרבית בת 24 בארות מלאה ב-HBSS.
אתר את הפרוסה באמצע הבאר ולאחר מכן הסר את פתרון ה- HBSS עם פיפטה. תחת מיקרוסקופ, מצאו את נתיב הנשימה וכלי הדם של המטרה בפרוסה ולאחר מכן כסו אותה באמצעות רשת ניילון עם חור מרכזי חתוך מראש כדי לחשוף את אזור כלי הדם הממוקד. הניחו מכונת כביסה ממתכת חלולה על גבי הרשת כדי להחזיק את הפרוסות במקומן.
לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטרים של פתרון HBSS כדי להטביע את הפרוסות. לאחר 10 דקות, הקלט את תמונות הבסיס. כדי לגרום להתכווצות דרכי הנשימה או כלי הדם, הסר בזהירות את תמיסת HBSS עם פיפטה והוסף 600 מיקרוליטרים של HBSS עם אגוניסט.
כדי להכין את מאגר טעינת צבע הסידן, תחילה להמיס 50 מיקרוגרם של צבע עם 10 מיקרוליטרים של DMSO ו 0.2 גרם של אבקת F-12 פלורונית ב 1 מיליליטר של DMSO. ערבבו 10 מיקרוליטרים של תמיסת פלורוני עם 10 מיקרוליטרים של תמיסת צבע סידן. הוסיפו את התערובת הזו ל-2 מיליליטרים של תמיסת HBSS המכילה 200 מיקרומולר של סולפובירומופתליין.
לאחר מכן, מניחים 15 פרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק ב-2 מיליליטרים של מאגר העמסת סידן ודגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, ולאחר מכן דגירה ב-HBSS המכילה 100 מיקרומולאר סולפובירומופתליין למשך 30 דקות. לאחר מכן, מניחים פרוסות טעונות צבע סידן על כיסוי גדולה. מלאו שומן סיליקון בוואקום גבוה במזרק 3 מיליליטר המחובר למחט קהה 18G או לקצה פיפטה 200 מיקרוליטר וציירו שני קווים מקבילים על פני זכוכית הכיסוי, מעל ומתחת לפרוסה.
מכסים את הפרוסה באמצעות רשת ניילון בין שני קווי שומן. מניחים את זכוכית הכיסוי השנייה על גבי הרשת כדי ליצור תא. הוסף HBSS או תמיסה אגוניסטית לתוך החדר מקצה אחד עם פיפטה.
הסר את הנוזל מהתא על ידי יניקה מהקצה השני עם נייר טישו. תא הפרוסה מוכן כעת להדמיית הסידן עם מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר במהירות גבוהה. צרורות עורקי דרכי הנשימה הריאתיים נצפו בפרוסות ריאה חתוכות במדויק בעובי 150 מיקרומטרים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
במצב מנוחה, זוהתה דרכי הנשימה על ידי תאי אפיתל קובידליים עם עורק ריאתי סמוך. בעקבות חשיפה למתכולין, האזור הלומינלי הצטמצם ואילו עורק הריאה לא הראה תגובה לגירויים. תגובות התכווצות דרכי הנשימה כומתו על ידי אחוז הירידה באזור הלומינלי והראו תגובות תלויות מינון דומות בתרביות של יום אחד וחמישה ימים.
עם ההגעה לשדה הריאה ההיקפי, דרכי הנשימה המוליכות מסתעפות לצינורות נשימה ושקים המקיפים את העורקים התוך-אסינאריים הקטנים. כאשר נחשפים לאנדותלי הן דרכי הנשימה והן העורקים הריאתיים מתכווצים, ולאחר מכן הרפיה המושרה על ידי NOC-5. במצב המנוחה, פרוסות טעונות צבע הסידן הראו פלואורסצנטיות נמוכה בתאי השריר החלקים של דרכי הנשימה ומערכת כלי הדם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי.
עם החשיפה לאגוניסטים, עוצמת הפלואורסצנציה של הסידן עלתה בתאים והתפשטה לתא כולו, אשר תאם את האותות המתנדנדים. טכניקה חכמה, זה חיוני כדי לנפח את הריאה עם agarose באופן הומוגני ולהימנע הזרקת אגרוז מהירה או מוגזמת. תמיד לדחוף אוויר בקצה כדי לשטוף את האגרוז מדרכי הנשימה המוליכות אל חלל הנאדיות הדיסטליות.
לסיכום, באמצעות תרבית פרוסות הריאה החתוכה באופן מדויק, ניתן לספק מגוון מיוחד של תפקודי שרירים חלקים ריאתיים ולדגום את דה-ויסות השרירים החלק במבחנה. הוא גם מספק פלטפורמה אידיאלית לסינון תרופות נובו vasodilatory או ברונכודילטור.
