Le PCLS soutient l’évaluation de l’activité des voies respiratoires et des cellules musculaires lisses vasculaires dans un environnement tissulaire presque intact, fournissant ainsi un modèle ex vivo inestimable pour la recherche pulmonaire. En termes de recherche sur les muscles lisses, les tranches pulmonaires coupées avec précision préservent le phénotype in vivo des cellules musculaires lisses et leur interaction avec les structures environnantes tout en permettant l’accès aux cellules musculaires lisses, ce qui est important pour une étude mécaniste au niveau cellulaire. Pour commencer, placez le corps de la souris sur une planche de dissection en position couchée.
Épinglez la queue, les pattes avant et la tête avec des aiguilles de seringue 25G et désinfectez le corps avec de l’éthanol à 70%. Ouvrez soigneusement la cavité thoracique le long du sternum et de la cage thoracique inférieure bilatérale au-dessus du diaphragme. Ensuite, pointez la pointe de ciseaux pointue loin du tissu pulmonaire et retirez une partie des cages thoraciques ventrales bilatérales pour exposer le cœur.
Observez que les lobes pulmonaires s’effondrent lorsque la cavité thoracique s’ouvre. Utilisez des ciseaux pour enlever les tissus mous dans le cou de la souris afin d’exposer la trachée. À l’extrémité supérieure de la trachée, faites un petit trou de diamètre de 1,2 millimètre qui devrait permettre le passage d’une pointe de cathéter IV en forme de Y de 20 G.
Connectez un port adaptateur du cathéter en forme de Y avec une seringue de 3 millilitres préremplie de 0,5 millilitre d’air et l’autre port avec une seringue de 3 millilitres préremplie de 2 millilitres de solution d’agarose à 1,5% chauffée à 42 degrés Celsius. Injecter une solution d’agarose pour remplir le cathéter, puis pousser le cathéter à travers l’ouverture dans la trachée à 5 à 8 millimètres. Injecter lentement la solution d’agarose à raison de 1 millilitre toutes les 5 secondes.
Observez que le poumon se dilate le long de l’axe proximal à distal. Arrêtez l’injection lorsque le bord de chaque lobe pulmonaire est gonflé. Ensuite, injectez 0,2 à 0,3 millilitre d’air de l’autre seringue pour pousser l’agarose résiduelle dans les voies respiratoires conductrices vers l’espace des alvéoles distales.
Clip a fermé la trachée avec une paire de pinces hémostatiques incurvées. Pour remplir le système vasculaire pulmonaire, remplissez une seringue de 1 millilitre avec de la gélatine chaude de 6% et connectez-la à un cathéter veineux du cuir chevelu à aiguille. Remplissez le cathéter avec une solution de gélatine, puis perforez le ventricule droit près de la paroi inférieure avec l’aiguille.
Poussez l’aiguille de 2 à 3 millimètres dans le ventricule droit et pointez la pointe de l’aiguille vers l’artère pulmonaire principale. Injecter environ 0,2 millilitre de solution de gélatine lentement dans le ventricule droit et les vaisseaux artériels pulmonaires. Gardez l’aiguille en place pendant cinq minutes après l’injection et refroidissez les lobes pulmonaires en versant une solution HBSS glacée sur le cœur et les poumons et placez le corps dans un réfrigérateur.
Après cette étape, retirez le poumon et le cœur de la souris des tissus conjonctifs environnants avec des ciseaux. Ensuite, séparez chaque lobe pulmonaire et conservez-les dans une solution HBSS sur de la glace. Coupez le lobe pulmonaire et orientez-le de manière à ce que la direction de coupe soit perpendiculaire à la plupart des voies respiratoires, de la hile à la surface du poumon.
Fixez-le sur le dessus de la colonne de l’échantillon avec de la super colle. Utilisez un vibratome avec une lame de rasoir mince et fraîche pour couper le lobe pulmonaire en tranches de 150 micromètres. Recueillir les tranches dans des boîtes de Petri stériles préremplies avec une solution HBSS froide.
Transférer les tranches dans des boîtes de Petri remplies de milieu de culture DMEM/F-12. Placez les plats dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit avant les expériences. Placez une seule tranche de poumon coupée avec précision dans chaque puits d’une plaque de culture de 24 puits remplie de HBSS.
Placez la tranche au milieu du puits, puis retirez la solution HBSS à l’aide d’une pipette. Au microscope, trouvez les voies respiratoires et le récipient cibles dans la tranche, puis recouvrez-les à l’aide d’un maillage en nylon avec un trou central prédécoupé pour exposer la zone des vaisseaux des voies respiratoires ciblée. Placez une rondelle métallique creuse sur le dessus de la maille pour maintenir les tranches en place.
Ensuite, ajoutez 600 microlitres de solution HBSS pour immerger les tranches. Après 10 minutes, enregistrez les images de référence. Pour induire la contraction des voies respiratoires ou vasculaires, retirez prudemment la solution HBSS avec une pipette et ajoutez 600 microlitres de HBSS avec un agoniste.
Pour préparer le tampon de chargement du colorant calcique, dissolvez d’abord 50 microgrammes de colorant avec 10 microlitres de DMSO et 0,2 gramme de poudre pluronique F-12 dans 1 millilitre de DMSO. Mélanger 10 microlitres de la solution Pluronic avec 10 microlitres de solution de colorant calcique. Ajouter ce mélange à 2 millilitres de solution HBSS contenant 200 micromolaires de sulfobromophtaléine.
Ensuite, placez 15 tranches de poumons coupées avec précision dans 2 millilitres de tampon de charge de calcium et incubez à 30 degrés Celsius pendant une heure, puis incubez dans hbSS contenant 100 micromolaires sulfobromophtaléine pendant 30 minutes. Ensuite, placez les tranches chargées de colorant de calcium sur un grand verre de couverture. Remplissez la graisse de silicone sous vide poussé dans une seringue de 3 millilitres attachée à une aiguille émoussée de 18 G ou à une pointe de pipette de 200 microlitres et tracez deux lignes parallèles à travers le verre de couverture, au-dessus et au-dessous de la tranche.
Couvrir la tranche à l’aide d’un maillage en nylon entre deux lignes de graisse. Placez le deuxième verre de couverture sur le dessus de la maille pour générer une chambre. Ajouter HBSS ou une solution agoniste dans la chambre à partir d’une extrémité avec une pipette.
Retirez le liquide de la chambre en aspirant de l’autre extrémité avec du papier de soie. La chambre de la tranche est maintenant prête pour l’imagerie calcique avec un microscope confocal à balayage laser à grande vitesse. Des faisceaux d’artères des voies respiratoires pulmonaires ont été observés dans des tranches pulmonaires découpées avec précision d’une épaisseur de 150 micromètres sous un microscope à contraste de phase.
À l’état de repos, une voie respiratoire a été identifiée par des cellules épithéliales cuboïdes avec une artère pulmonaire voisine. Après l’exposition à la méthachiline, la zone luminale a été réduite tandis que l’artère pulmonaire n’a montré aucune réponse aux stimuli. Les réponses contractiles des voies respiratoires ont été quantifiées par le pourcentage de réduction de la surface luminale et ont montré des réponses dose-dépendantes similaires dans des cultures d’un jour et de cinq jours.
En atteignant le champ pulmonaire périphérique, les voies respiratoires conductrices se ramifient dans les canaux respiratoires et les sacs entourant les petites artérioles intra-acineuses. Lorsqu’elles sont exposées à des endothélii, les voies respiratoires et les artères pulmonaires se contractent, suivies d’une relaxation induite par le NOC-5. À l’état de repos, les tranches chargées de colorant de calcium ont montré une faible fluorescence dans les cellules musculaires lisses des voies respiratoires et du système vasculaire sous un microscope fluorescent confocal.
Lors de l’exposition aux agonistes, l’intensité de la fluorescence du calcium s’est élevée dans les cellules et s’est propagée à la cellule entière, ce qui était en corrélation avec les signaux oscillatoires. Sur le plan technique, il est essentiel de gonfler le poumon avec de l’agarose de manière homogène et d’éviter une injection rapide ou excessive d’agarose. Poussez toujours l’air à la fin pour rincer l’agarose des voies respiratoires conductrices vers l’espace des alvéoles distales.
En résumé, en utilisant la culture de tranches pulmonaires coupées avec précision, on peut fournir une variété spéciale de fonctions musculaires lisses pulmonaires et modéliser la dérégulation des muscles lisses in vitro. Il fournit également une plate-forme idéale pour dépister les médicaments vasodilatateurs ou bronchodilatateurs novos.
