Das PCLS unterstützt die Beurteilung der Aktivität der Atemwege und der glatten Gefäßmuskulatur in einer nahezu intakten Gewebeumgebung und liefert damit ein unschätzbares Ex-vivo-Modell für die Lungenforschung. In Bezug auf die glatte Muskelforschung erhalten die präzisionsgeschnittenen Lungenschnitte den In-vivo-Phänotyp der glatten Muskelzellen und ihre Interaktion mit umgebenden Strukturen und ermöglichen gleichzeitig den Zugang zu glatten Muskelzellen, was für eine mechanistische Untersuchung auf zellulärer Ebene wichtig ist. Platzieren Sie zunächst den Mauskörper auf einem Sezierbrett in Rückenlage.
Stecken Sie den Schwanz, die Vorderpfoten und den Kopf mit 25G Spritzennadeln fest und desinfizieren Sie den Körper mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig entlang des Brustbeins und des bilateralen unteren Brustkorbs über dem Zwerchfell. Richten Sie dann die scharfe Scherenspitze vom Lungengewebe weg und entfernen Sie einen Teil der bilateralen ventralen Brustkäfige, um das Herz freizulegen.
Beobachten Sie, dass die Lungenlappen kollabieren, wenn sich die Brusthöhle öffnet. Verwenden Sie eine Schere, um Weichgewebe im Maushals zu entfernen, um die Luftröhre freizulegen. Am oberen Ende der Luftröhre machen Sie ein kleines Loch mit einem Durchmesser von 1,2 Millimetern, das das Passieren einer 20G Y-förmigen IV-Katheterspitze ermöglichen sollte.
Verbinden Sie einen Adapteranschluss des Y-förmigen Katheters mit einer 3-Milliliter-Spritze, die mit 0,5 Millilitern Luft vorgefüllt ist, und den anderen Anschluss mit einer 3-Milliliter-Spritze, die mit 2 Millilitern 1,5% Agaroselösung vorgefüllt ist, die auf 42 Grad Celsius erwärmt ist. Injizieren Sie Agaroselösung, um den Katheter zu füllen, und drücken Sie dann den Katheter durch die Öffnung in die Luftröhre auf 5 bis 8 Millimeter. Injizieren Sie die Agaroselösung langsam mit einer Rate von 1 Milliliter pro 5 Sekunden.
Beobachten Sie, dass sich die Lunge entlang der proximalen bis distalen Achse ausdehnt. Stoppen Sie die Injektion, wenn der Rand jedes Lungenlappens aufgeblasen ist. Injizieren Sie dann 0,2 bis 0,3 Milliliter Luft aus der anderen Spritze, um die Restagarose in leitende Atemwege in den distalen Alveolenraum zu drücken.
Clip schloss die Luftröhre mit einem Paar gekrümmter hämostatischer Pinzetten. Um das Lungengefäßsystem zu füllen, füllen Sie eine 1-Milliliter-Spritze mit warmer 6% Gelatine und verbinden Sie sie mit einem Nadel-Kopfhautvenenkatheter. Füllen Sie den Katheter mit Gelatinelösung und punktieren Sie dann den rechten Ventrikel in der Nähe der unteren Wand mit der Nadel.
Drücken Sie die Nadel für 2 bis 3 Millimeter in den rechten Ventrikel und richten Sie die Nadelspitze auf die Hauptlungenarterie. Injizieren Sie etwa 0,2 Milliliter Gelatinelösung langsam in den rechten Ventrikel und die pulmonalen arteriellen Gefäße. Halten Sie die Nadel nach der Injektion fünf Minuten an Ort und Stelle und kühlen Sie die Lungenlappen, indem Sie eiskalte HBSS-Lösung auf Herz und Lunge gießen und den Körper in einen Kühlschrank stellen.
Entfernen Sie nach diesem Schritt die Mauslunge und das Herz mit einer Schere aus dem umgebenden Bindegewebe. Trennen Sie dann jeden Lungenlappen und bewahren Sie ihn in HBSS-Lösung auf Eis auf. Schneiden Sie den Lungenlappen und richten Sie ihn so aus, dass die Schnittrichtung senkrecht zu den meisten Atemwegen von der Hila bis zur Lungenoberfläche verläuft.
Befestigen Sie es mit Sekundenkleber auf der Probensäule. Verwenden Sie ein Vibratom mit einer frischen, dünnen Rasierklinge, um den Lungenlappen in 150-Mikrometer-Scheiben zu schneiden. Sammeln Sie die Scheiben in sterilen Petrischalen vorgefüllt mit kalter HBSS-Lösung.
Die Scheiben in Petrischalen geben, die mit DMEM/F-12-Kulturmedium gefüllt sind. Stellen Sie das Geschirr über Nacht vor den Experimenten in einen 37 Grad Celsius-Inkubator. Legen Sie eine einzelne präzisionsgeschnittene Lungenscheibe in jede Vertiefung einer mit HBSS gefüllten 24-Well-Kulturplatte.
Suchen Sie die Scheibe in der Mitte der Vertiefung und entfernen Sie dann die HBSS-Lösung mit einer Pipette. Suchen Sie unter einem Mikroskop die Zielatemwege und das Zielgefäß in der Scheibe und bedecken Sie sie dann mit einem Nylonnetz mit einem vorgeschnittenen zentralen Loch, um den Zielbereich des Atemwegsgefäßes freizulegen. Legen Sie eine hohle Metallscheibe auf das Netz, um die Scheiben an Ort und Stelle zu halten.
Fügen Sie dann 600 Mikroliter HBSS-Lösung hinzu, um die Scheiben einzutauchen. Zeichnen Sie nach 10 Minuten die Baseline-Bilder auf. Um die Atemwegs- oder Gefäßkontraktion zu induzieren, entfernen Sie vorsichtig die HBSS-Lösung mit einer Pipette und fügen Sie 600 Mikroliter HBSS mit einem Agonisten hinzu.
Um den Calciumfarbstoff-Ladepuffer herzustellen, lösen Sie zunächst 50 Mikrogramm Farbstoff mit 10 Mikrolitern DMSO und 0,2 Gramm Pluronic F-12-Pulver in 1 Milliliter DMSO auf. Mischen Sie 10 Mikroliter der Plunonic-Lösung mit 10 Mikrolitern Calciumfarbstofflösung. Fügen Sie diese Mischung zu 2 Millilitern HBSS-Lösung hinzu, die 200 Mikromolar Sulfobromphthalein enthält.
Legen Sie dann 15 präzisionsgeschnittene Lungenscheiben in 2 Milliliter Kalziumladepuffer und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubation in HBSS mit 100 Mikromolar Sulfobromphthalein für 30 Minuten. Legen Sie dann mit Kalziumfarbstoff beladene Scheiben auf ein großes Deckglas. Füllen Sie Hochvakuum-Silikonfett in eine 3-Milliliter-Spritze, die an einer 18G stumpfen Nadel oder einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze befestigt ist, und zeichnen Sie zwei parallele Linien über das Deckglas, über und unter der Scheibe.
Decken Sie die Scheibe mit einem Nylonnetz zwischen zwei Fettlinien ab. Legen Sie das zweite Deckglas auf das Netz, um eine Kammer zu erzeugen. Fügen Sie HBSS oder eine Agonistenlösung von einem Ende mit einer Pipette in die Kammer hinzu.
Entfernen Sie die Flüssigkeit aus der Kammer, indem Sie vom anderen Ende mit Seidenpapier absaugen. Die Kammer der Scheibe ist nun bereit für die Kalziumbildgebung mit einem Hochgeschwindigkeits-Laserscanning-Konfokalmikroskop. Lungenarterienbündel wurden in präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten von 150 Mikrometern Dicke unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet.
Im Ruhezustand wurde ein Atemweg durch quaderförmige Epithelzellen mit einer nahe gelegenen Lungenarterie identifiziert. Nach der Exposition gegenüber Methacholin wurde die luminale Fläche reduziert, während die Lungenarterie keine Reaktion auf die Reize zeigte. Die kontraktilen Reaktionen der Atemwege wurden durch den Prozentsatz der luminalen Flächenreduktion quantifiziert und zeigten ähnliche dosisabhängige Reaktionen in Ein-Tages- und Fünf-Tages-Kulturen.
Beim Erreichen des peripheren Lungenfeldes verzweigen sich die leitfähigen Atemwege in Atemwege und Säcke, die die kleinen intra-acinaren Arteriolen umgeben. Bei Exposition gegenüber Endotheln verengen sich sowohl die Atemwege als auch die Lungenarterien, gefolgt von einer NOC-5-induzierten Relaxation. Im Ruhezustand zeigten die mit Kalziumfarbstoffen beladenen Scheiben eine geringe Fluoreszenz in den glatten Muskelzellen der Atemwege und des Gefäßsystems unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop.
Bei Exposition gegenüber Agonisten erhöhte sich die Kalziumfluoreszenzintensität in den Zellen und breitete sich auf die gesamte Zelle aus, was mit den oszillierenden Signalen korrelierte. Technisch ist es wichtig, die Lunge homogen mit Agarose aufzublasen und eine schnelle oder übermäßige Agaroseinjektion zu vermeiden. Drücken Sie immer Luft am Ende, um die Agarose von den leitenden Atemwegen in den distalen Alveolenraum zu spülen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass man mit der präzisionsgeschnittenen Lungenschnittkultur eine besondere Vielfalt an Funktionen der glatten Lungenmuskulatur bereitstellen und die Deregulation der glatten Muskulatur in vitro modellieren kann. Es bietet auch eine ideale Plattform, um novo vasodilatatorische oder bronchodilatatorische Medikamente zu screenen.
