PCLSは、ほぼ無傷の組織環境における気道および血管平滑筋細胞活性の評価をサポートし、それによって肺研究のための非常に貴重なエクスビボモデルを提供する。平滑筋研究の面では、精密に切断された肺スライスは、平滑筋細胞のin vivo表現型およびそれらの周囲構造との相互作用を維持しながら、平滑筋細胞へのアクセスを可能にするが、これは細胞レベルでの機構的研究にとって重要である。まず、マウスの本体を仰臥位の解剖ボードの上に置きます。
尾、前足、および頭を25Gシリンジ針で固定し、70%エタノールで体を消毒します。胸骨と横隔膜の上の両側下胸郭に沿って胸腔を慎重に開きます。次に、鋭いはさみの先端を肺組織から遠ざけ、両側腹側胸郭の一部を取り外して心臓を露出させます。
胸腔が開くと肺葉が崩壊することを確認します。はさみを使用してマウス首の軟部組織を除去し、気管を露出させます。気管の上端に直径1.2ミリメートルの小さな穴を開けて、20G Y字型のIVカテーテルチップを通過させる必要があります。
Y字型カテーテルの一方のアダプターポートを、0.5ミリリットルの空気を予め充填した3ミリリットルのシリンジに接続し、もう一方のポートを摂氏42度に温めた2ミリリットルの1.5%アガロース溶液を予め充填した3ミリリットルのシリンジに接続します。アガロース溶液を注入してカテーテルを満たし、次にカテーテルを開口部から気管内に5〜8ミリメートルに押し込む。アガロース溶液を5秒あたり1ミリリットルの速度でゆっくりと注入する。
肺が近位から遠位軸に沿って膨張するのを観察してください。各肺葉の端が膨らんだら注射を停止します。次に、他のシリンジから0.2〜0.3ミリリットルの空気を注入し、残留アガロースを遠位肺胞腔への導電性気道に押し込む。
クリップは、一対の湾曲した止血鉗子で気管を閉じた。肺血管系を充填するには、1ミリリットルのシリンジに暖かい6%ゼラチンを入れ、針頭皮静脈カテーテルに接続します。カテーテルにゼラチン溶液を充填し、下壁に近い右心室を針で穿刺する。
針を右心室に2〜3ミリメートル押し込み、針先を主肺動脈に向けます。約0.2ミリリットルのゼラチン溶液を右心室および肺動脈血管にゆっくりと注入する。注射後5分間針を所定の位置に保ち、氷冷HBSS溶液を心臓と肺に注いで肺葉を冷やし、体を冷蔵庫に入れます。
このステップの後、はさみで周囲の結合組織からマウスの肺と心臓を取り除きます。次に、各肺葉を分離し、氷上のHBSS溶液に保管します。肺葉をトリミングし、切断方向がヒラから肺表面までのほとんどの気道に対して垂直になるように向きます。
スーパー接着剤で試料カラムの上に取り付けます。新鮮な薄いカミソリの刃でビブラトームを使用して、肺葉を150マイクロメートルのスライスに切断します。冷たいHBSS溶液を予め充填した滅菌ペトリ皿にスライスを集める。
スライスをDMEM/F-12培養液で満たされたペトリ皿に移します。実験の前に一晩37°Cのインキュベーターに皿を置きます。HBSSで満たされた24ウェル培養プレートの各ウェルに単一の精密切断肺スライスを置きます。
ウェルの中央にあるスライスの位置を確認し、ピペットでHBSS溶液を取り出します。顕微鏡下で、スライス内の標的気道および血管を見つけ、次に、標的気道血管領域を露出させるために、予め切断された中央穴を有するナイロンメッシュを使用してそれを覆う。メッシュの上に中空の金属ワッシャーを置き、スライスを所定の位置に保持します。
次に、600マイクロリットルのHBSS溶液を加えてスライスを沈める。10 分後、ベースライン イメージを記録します。気道または血管収縮を誘導するには、HBSS溶液をピペットで慎重に除去し、アゴニストと共に600マイクロリットルのHBSSを加える。
カルシウム色素ローディングバッファーを調製するには、まず、50マイクログラムの色素を10マイクロリットルのDMSOおよび0.2グラムのプルロニックF-12粉末とともに1ミリリットルのDMSOに溶解する。10マイクロリットルのプルロニック溶液と10マイクロリットルのカルシウム色素溶液を混合する。この混合物を、200マイクロモルのスルホブロモフタレインを含む2ミリリットルのHBSS溶液に加える。
次いで、2ミリリットルのカルシウムローディングバッファーに15個の精密切断肺スライスを入れ、摂氏30度で1時間インキュベートし、続いて100マイクロモルのスルホブロモフタレインを含むHBSS中で30分間インキュベートした。次に、カルシウム色素を装填したスライスを大きなカバーガラスの上に置きます。高真空シリコーングリースを18G鈍針または200マイクロリットルピペットチップに取り付けられた3ミリリットルのシリンジに充填し、カバーガラスを横切ってスライスの上下に2本の平行線を引きます。
2本のグリースラインの間にナイロンメッシュを使用してスライスを覆います。2 番目のカバー ガラスをメッシュの上に置き、チャンバーを生成します。HBSSまたはアゴニスト溶液をピペットで一端からチャンバーに入れる。
ティッシュペーパーでもう一方の端から吸引することによってチャンバから流体を取り出す。スライスのチャンバーは、高速レーザー走査共焦点顕微鏡によるカルシウムイメージングの準備が整いました。肺気道動脈束を、位相差顕微鏡下で厚さ150マイクロメートルの精密切断肺スライスで観察した。
安静状態では、近くの肺動脈を有する直方体上皮細胞によって気道が同定された。メタコリンへの曝露後、肺動脈は刺激に対する応答を示さなかったが、内腔領域は減少した。気道収縮応答は、管腔面積減少の割合によって定量化され、1日および5日間の培養において同様の用量依存性応答を示した。
末梢肺野に到達すると、導電性気道は、小さな腺房内細動脈を囲む気管および嚢に分岐する。内皮に曝されると、気道および肺動脈の両方が収縮し、続いてNOC-5誘導弛緩が続く。安静状態では、カルシウム色素装填スライスは、共焦点蛍光顕微鏡下で気道および血管系の平滑筋細胞において低い蛍光を示した。
アゴニストに曝露すると、カルシウム蛍光強度は細胞内で上昇し、細胞全体に伝播し、これは振動シグナルと相関した。賢明なテクニックでは、肺をアガロースで均質に膨張させ、迅速または過剰なアガロース注射を避けることが不可欠です。常に最後に空気を押して、アガロースを導電性気道から遠位肺胞空間に洗い流します。
要約すると、精密切断肺スライス培養物を使用して、特別な様々な肺平滑筋機能を提供し、インビトロで平滑筋調節解除をモデル化することができる。また、novo血管拡張薬または気管支拡張薬をスクリーニングするための理想的なプラットフォームを提供します。
