Наш протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет как экономически эффективным, так и своевременным дереплицией известных антибиотиков без использования специализированного оборудования. Основным преимуществом этой техники является настройка шаблонов. Это означает, что человек может адаптировать гены резистентности, которые они хотят включить в свой шаблон библиотеки, основываясь на желаемом уровне широкой или узкой субстратной специфичности.
Например, бета-лактам выражает E.coli шаблон может быть подготовлен для того, чтобы для весьма специфической дерепликации бета-лактамов и их различных подклассов. Используя септик, пипетка 500 микролитров катионной регулируется MHB из стерильного резервуара в каждый колодец стерильной, 96 глубокой пластины хорошо. С подготовленными пластинами штамма ARP или MARP используйте аппликаторную палочку для прививки пластины 96 глубоких колодец в соответствии с картой ARP или MARP.
Поместите дышащий уплотнительной мембраны на поверхности глубокой пластины хорошо и инкубировать его на ночь при 37 градусов по Цельсию, 250 об /мин. Убедитесь, что нет загрязненных скважин. Используя многоканальную пипетку, перенесите 100 микролитров из каждого колодец глубокой пластины хорошо в стерильную 96-хорошо круглую нижнюю пластину.
Добавьте 100 микролитров стерильного 50%глицерола в каждую колодец и смешайте, аккуратно трубя вверх и вниз. Подготовь как минимум пять библиотечных тарелок. Обложка пластины с стерильными алюминиевыми уплотнениями и убедитесь, что каждый колодец индивидуально запечатаны.
Поместите крышку пластины поверх алюминиевого уплотнения и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Используя деревянную палку аппликатора, аккуратно соскребать споры с поверхности стрептомицей колонии и перенести его в пробирку, содержащую один стерильный стеклянный шарик и три миллилитров стрептомицей антибиотика среды. Закрыть пробирку свободно с крышкой, чтобы аэрация.
Используя ту же деревянную палку аппликатора, полоса контроля стерильности на чашке Петри, содержащей агар Беннетта. Инкубировать трубку, содержащую культуру семян при 30 градусах по Цельсию с аэрацией в течение шести дней при 250 об/мин и стерильную контрольную пластину при 30 градусах по Цельсию в течение шести дней. Затем, на ровень поверхности, подготовить dereplication пластин.
Аспират 23 миллилитров теплого агара Беннетта в серологическую пипетку и равномерно распределить 20 миллилитров по всей поверхности прямоугольной чашки Петри, оставляя оставшуюся часть среды в пипетке, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Накройте тарелку крышкой. Аккуратно поверните пластину до тех пор, пока среда не накрывет все области пластины и не беспокоить его, пока агар не установит полностью.
Затем подготовьте мембранные листы нитроцеллюлозы, используя прямоугольную крышку чашки Петри в качестве шаблона трассировки, чтобы листы соответствовали поверхности пластины дереплиции. Вырезать листы и автоклав их в стерильный мешок. Теперь проверьте стерильную контрольную пластину, чтобы убедиться, что после шести дней инкубации загрязняющих веществ не присутствует.
При загрязнении, удалите крышку прямоугольной чашки Петри и пипетки 200 микролитров культуры семян на поверхность агара Беннетта в прямоугольной тарелке. Используйте стерильный ватный тампон, чтобы равномерно распределить культуру по всей пластине. Чтобы расположить подготовленную мембрану нитроцеллюлозы поверх культуры на поверхности чашки Петри, выровнять нижний край мембраны к нижнему краю чашки Петри и медленно применять мембрану от нижнего края до верхнего края пластины.
Используйте стерильный ватный тампон, чтобы сгладить любые пузырьки воздуха, которые, возможно, сформировались между интерфейсом мембранного агара, гарантируя, что мембрана заподлицо с агаром. Мембрана позволяет организмам sporulate на своей поверхности в то время как вторичные метаболиты могут быть выведены в среде ниже. Положите крышку обратно на прямоугольную чашку Петри и поместите его вверх ногами в запечатанный полиэтиленовый пакет.
Инкубировать при 30 градусах по Цельсию в течение шести дней. Через шесть дней снимите де теплицу с инкубатора. Используя стерильные пинцеты, тщательно удалите мембрану нитроцеллюлозы с поверхности агара Беннетта.
Убедитесь, что есть только незначительный рост спор по краям пластины, чтобы уменьшить шансы загрязнения наложения, которые будут добавлены. Убедитесь, что рабочая поверхность является ровной и использовать серологическую пипетку, чтобы аспирировать 23 миллилитров теплой катионики скорректированы MHB агара. Создайте наложение, распределяя 20 миллилитров равномерно по всей поверхности пластины dereplication, оставляя оставшуюся часть агара в пипетки, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.
Поместите крышку на тарелку. Аккуратно поверните пластину до тех пор, пока среда не покрывает все области и не беспокоить его, пока агар не установит полностью. После охлаждения и затвердевания, верните пластину dereplication в запечатанный полиэтиленовый пакет и храните его вверх ногами при четырех градусах Цельсия на ночь, что позволяет диффузии вторичных метаболитов в MHB агар наложения.
В тот же день, привить свежий шаблон ARP или MARP, сначала пипетки 100 микролитров катион скорректированы MHB в каждой колодец 96-хорошо пластины. Возьмите замороженный запас ARP или MARP библиотеки пластины из минус 80 градусов по Цельсию морозильник. Удалите алюминиевый уплотнитель до того, как конденсат начнет формироваться на его нижней стороне.
Используя стерильные 96-ну закрепления инструменты, тщательно контактный из замороженных запасов ARP или MARP библиотечной пластины и привить свежие MHB содержащие 96-хорошо пластин. Чтобы свести к минимуму загрязнение во время дерепликации, подготовьте как можно больше библиотечных пластин ARP или MARP, необходимых только для dereplicate от двух до трех пластин dereplication на библиотечную пластину. После завершения, положить новый стерильный алюминиевый уплотнение на замороженный шаблон и вернуть его в минус 80 градусов по Цельсию морозильник.
Поместите привитые пластины 96-колодец внутри слабо запечатанного полиэтиленового пакета и инкубировать при 37 градусах по Цельсию с тряской при 250 об/мин в течение 18 часов. Удалите шаблон ARP или MARP из инкубатора и убедитесь, что загрязняющих веществ нет, сравнив пластину с картой шаблонов ARP или MARP. Удалите де теплицы от четырех градусов по Цельсию и дайте равноденствия до комнатной температуры.
Если есть конденсат, откройте крышки и дайте высохнуть в стерильной среде. Используя стерильные инструменты закрепления, булавку из библиотечной пластины ARP или MARP на поверхности агара MHB наложения дееплицийных пластин. Будьте осторожны, чтобы не проколоть агар.
Разрешить шаблон инокулума высохнуть в течение трех-пяти минут. Поместите привитые плиты дерепликации вверх ногами в запечатанный полиэтиленовый пакет и инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию. На следующий день проанализируйте результаты дерепликации, сравнив рост на плите дееплиции с скважинами, которые соответствуют карте ARP или MARP.
В этом рабочем процессе ARP или MARP dereplication был достигнут положительный результат дерепликации. В этом случае экстракт, подготовленный для штамма WAC 8921, был идентифицирован как производитель хлорамфеникол. Отсутствие роста ARP указывает на наличие либо неизвестного антибиотика, либо менее часто встречающихся антибиотиков, которые не учитывались в библиотечной пластине ARP или MARP.
Модель роста, уникальная для MARP, была сформирована из-за его использования как дикого типа E.coli BW25113, так и сверхпроницаемого и электронного потока дефицитного мутанта E.coli BW25113 bamB tolC. Этот результат свидетельствует о наличии соединения с антимикробной активностью, которое не смогло превзойти нетронутую внешнюю мембрану. Эта модель роста E.coli предполагает неправильную стерилизацию инструментов закрепления, что приводит к передаче неизвестных штаммов E.coli через наложение.
И пример ARP или MARP замороженных фондовых библиотек пластин загрязнения показано здесь с тремя различными колониями E.coli, выращенных на прямоугольной поверхности чашки Петри. Этот результат указывает на то, что наложения агара были проколоты во время дерепликации. Загрязнение, связанное с наложением MHB, также может возникать в процессе дереплиции, показывая нерегулярную модель роста на поверхности наложения.
Самое главное помнить, когда после этого протокола является использование надлежащей стерилизации и асептических методов для того, чтобы убедиться, что вы не задержаны в любом шаге из-за загрязнения. Это включает в себя подготовку нитроцеллюлозы мембраны так, что она соответствует поверхности агар пластины Беннетта как можно ближе, с тем чтобы свести к минимуму распространение спор при заливке MHB наложения. Кроме того, также чрезвычайно важно использовать правильно стерилизованное оборудование для закрепления при инокулировании библиотечных пластин и дерепликации для получения наиболее чистого результата.
В дополнение к dereplicating известных антибиотиков, этот метод может быть применен к выявлению адъювантов, которые могут быть использованы в сочетании с существующими антибиотиками, чтобы спасти свою деятельность. Хотя антибиотик дерепликации не является новой техникой, он печально известен тем, что ресурсоемких и трудоемких. Платформа ARP и MARP помогает пролить свет на то, как дерепликация антибиотиков не должна быть большим производством, а может быть завершена в течение двух недель с использованием минимального оборудования.
