Этот метод помогает сравнить цитотоксическую активность различных типов клеток с помощью простого, недорогого метода, который не требует специального оборудования. Основным преимуществом этой техники является то, что она не требует использования опасных материалов, она недорогая и не требует использования специализированного оборудования. Этот метод может быть применен для измерения цитотоксической активности других типов клеток, таких как CD8 плюс цитолитические клетки или даже для оценки спонтанной смерти клеток без инкубации, без цитолитических клеток-эффекторов.
Индивидуалы новые к этому методу вероятно будут бороться с оптимизацией цели к соотношению клетки effector. Мой совет заключается в том, чтобы сделать тщательный поиск литературы, чтобы определить отношения, которые вы бы проверить при оптимизации протокола. Хотя этот метод не требует специальных навыков, кроме точной трубы, изоляция моноядерных клеток и установка анализной пластины являются шагами, которые легче понять и имитировать, если они наблюдаются визуально.
Демонстрацией процедуры будет Челси Джекелли, техник из моей лаборатории. Для начала этой процедуры добавьте 13,5 миллилитров RPMI в 1,5 миллилитров FBS в чашку Петри, содержащую 100-метровый фильтр. Поместите одну плаценту на фильтр и используйте плоскую сторону поршеня шприца, чтобы протолкнуть его через фильтр и в чашку Петри.
Далее, изготовив три 15-миллилитровых конических трубок для каждой ткани. Добавьте три миллилитров градиентной среды плотности к каждой трубке и медленно накладыв пять миллилитров однородной плаценты в каждую трубку. Центрифуга при температуре 300 Г и при комнатной температуре в течение 25 минут без перерыва.
Затем используйте перенесите пипетки, чтобы собрать тонкий белый слой баффи. Добавьте 10 миллилитров RPMI в комбинированные буйные слои. Центрифуга при 300 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут и отказаться от супернатанта.
Во-первых, повторно приостановить ячейки гранулы в 50 микролитров ледяной PBS. Добавьте антитела CD3 с маркировкой биотина в соответствии с протоколом производителя и хорошо перемешайте с пипеткой. Поместите трубку в трубчатый ротатор и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут.
Далее добавьте один миллилитр RPMI. Центрифуга при 400 градусах G и при четырех градусах По Цельсию в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы в один миллилитр RPMI.
Объедините клеточную подвеску со 150 микролитров магнитных бусин в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку. Перенесите трубку в трубчатый ротатор и поверните во время инкубации при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут. Во время инкубации извлечения буфера высвобождения и дайте ему достичь комнатной температуры в био-кабинете безопасности.
После завершения инкубации поместите трубку в магнит на одну минуту. Соберите супернатант и сохраните отрицательную популяцию клеток CD3 в 15-миллилитровой трубке на льду. Снимите трубку с магнита, добавьте один миллилитр RPMI и используйте пипетку, чтобы смешать клетки и бисер пять раз.
Затем поместите трубку обратно в магнит на одну минуту. Соберите супернатант и сохраните отрицательную популяцию CD3 в 15-миллилитровой трубке на льду. Центрифуга CD3 отрицательной популяции клеток в 400 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы клетки в 50 микролитров ледяного PBS. После этого, добавить биотин помечены CD161A антитела к CD3 отрицательных клеток, в соответствии с инструкциями производителя и хорошо перемешать. Поместите трубку в трубчатый ротатор и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут.
Затем добавьте один миллилитр RPMI и центрифугу при 400 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановите гранулу в один миллилитр RPMI и объедините ее с магнитными бусинами в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку. Поместите трубку в трубчатый ротатор и поверните во время инкубации при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут.
Затем поместите трубку в магнит на одну минуту. Соберите супернатант и отбросьте отрицательные отрицательные клетки CD161A CD161A. Снимите трубку с магнита, добавьте один миллилитр RPMI и хорошо перемешайте.
Поместите трубку в магнит на одну минуту, убедившись, что собирать супернатант и отказаться от CD3 отрицательных CD161A отрицательных клеток. После этого снимите трубку с магнита и добавьте один миллилитр буфера высвобождения комнатной температуры. Поместите трубку на трубчатый ротатор и поверните во время инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре.
Затем поместите трубку в магнит на одну минуту. Соберите супернатант в новую 15-миллилитровую коническую трубку на льду. Снимите трубку с магнита, добавьте один миллилитр комнатной температуры RPMI и хорошо перемешайте.
Поместите трубку обратно под магнит в течение одной минуты, убедившись, что собирать супернатант в той же 15-миллилитровой конической трубки. Хорошо перемешать и взять 20 микролитров образца для подсчета клеток. Центрифуга клетки при 400 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Удалите супернатант и повторно приостановит ячейки в RPMI. Семя клеток в шесть пластин хорошо при концентрации 300000 клеток на колодец в 2,5 миллилитров NK-клеток активации средств массовой информации. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом во влажном инкубаторе в течение 48 часов.
В капюшоне используйте серологическую пипетку для переноса клеток YAC1 в смил. в 50-миллилитровую трубку на льду и хорошо перемешайте. Возьмите 20 микролитер aliquot подсчитать клетки. Спин клетки при 300 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Используя серологическую пипетку, соберите супернатант из ранее подготовленной НК-клетки шесть хорошо пластины в 15 миллилитров конической трубки. Затем добавьте трипсин EDTA к каждой хорошо. Нажмите на тарелку и поместите его в инкубатор при 37 градусах по Цельсию.
После того, как клетки инкубировали трипсином ЭДТА в течение примерно пяти минут, используйте стерильный скребок пластины, чтобы соскребать пластину. Затем добавьте один миллилитр NK сотовых средств массовой информации для каждой хорошо. Используя серологическую пипетку, собирайте клетки и средства массовой информации и перенесите их в 15-миллилитровую центрифугу.
Возьмите 20 микролитер aliquot подсчитать клетки. Центрифуга НК клеток в 400 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Во-первых, получить круглое дно, культура рассматривается 96 хорошо пластины и установить его, как указано в таблице один из текстового протокола.
Центрифуга анализа пластины в 250 раз G в течение четырех минут, чтобы быть уверенным, что эффектор и целевые клетки находятся в контакте. Затем инкубировать пластину в увлажненной камере при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение пяти часов. За 45 минут до сбора супернатантов добавьте 10 микролитров раствора 10X лиза в скважины для высвобождения LDH целевой ячейки и верните пластину во влажную камеру.
Когда инкубация завершена, центрифуга пластины в 250 раз G в течение четырех минут, а затем использовать многоканарный пипеттер для передачи 50 микролитера aliquots из каждого хорошо свежие 96-ну, плоский нижний анализ пластины. Добавьте 50 микролитров анализатора реагента к каждому колодец анализной пластины. Накройте тарелку фольгой, чтобы защитить ее от света и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.
После этого добавьте 50 микролитров Stop Solution к каждой колодец. Убедитесь в том, чтобы прочитать пластину в течение одного часа после добавления Stop Solution и записать поглощение на 490 нанометров. Плацентарный НК-клеток, полученных из NP и RUPP крыс инкубируется в течение пяти часов с целевыми клетками в соответствующих средствах массовой информации в соотношении 50:1.
Здесь показаны необработанные данные о абсорбансе, зарегистрированные на 490 нанометров. Рассчитывается среднее абсорбции культурного среднего фона и скважины для контроля коррекции объема, и эти средние показатели вычитаются из соответствующих скважин, указанных в протоколе производителя. Исправленные значения затем используются для получения цитотоксичности с помощью протокола, предоставленного производителем.
Хотя этот метод не требует специальных навыков, кроме точной трубы, изоляция моноядерных клеток и установка анализной пластины являются шагами, которые легче понять и имитировать, если они наблюдаются визуально. После изоляции нк-клеток может быть проведен ряд других процедур, таких как эксперименты по совместной культуре для определения роли плацентарный НК-клеток в приписывая миграции трофибласта во время беременности. Мы также собираем средства массовой информации из расширенных НК-клеток для оценки цитокиназы, выделяется из дифференциально стимулируемых клеток.
Чистота изолированных клеток также может быть оценена с помощью цитометрии потока.
