В настоящее время признано, что системные эффекты первичных опухолей играют значительную роль в процессе метастатической диссеминации. Однако это часто упускается из виду в экспериментальных анализах метастазирования. Эта модель призвана предоставить исследователям способ оценить этот эффект.
Этот протокол включает оценку спонтанных метастазов после хирургического удаления первичной опухоли, что является клинически значимым. В основном, он также использует преимущества биолюминесцентной визуализации для мониторинга роста метастазов в легких в режиме реального времени. Эта экспериментальная установка может быть расширена для оценки фармакологических или генетических вмешательств при раке молочной железы в неоадъювантных условиях, а также значимости специфических сигнальных путей в метастатическом процессе.
Для начала соберите клетки путем аспирации среды для клеточных культур и промойте стерильным PBS. Затем инкубируйте с двумя миллилитрами 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в течение двух-трех минут при температуре 37 градусов Цельсия, пока клетки не отделятся, а затем промойте восемью миллиметрами готовой среды, чтобы погасить реакцию. После аспирации надосадочной жидкости и промывания клеток PBS ресуспендировать клетки в PBS в расчетном объеме, необходимом для разбавления клеток до 6 миллионов клеток на миллилитр.
Затем переложите клеточную суспензию в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки, и держите на льду до готовности к инъекции. Сбрейте шерсть на животе мыши, находящейся под наркозом, с помощью электрической машинки для стрижки, а затем поместите ее в лежачее положение. Далее очистите подготовленную область живота, используя 70% этанол и раствор повидон-йода.
С помощью ножниц сделайте небольшой разрез по средней линии через кожу живота на уровне четвертой молочной ткани, обнажая, но не проникая через нижележащую брюшину. Затем удерживайте кожу подальше от брюшины с помощью щипцов и отделите кожу от брюшины стерильными ватными палочками, смоченными в физрастворе, двигаясь в сторону, чтобы обнажить правый жировой пакет молочной железы, и повторите с левой стороны, чтобы обнажить левый жировой пакет. После ресуспензии клеточной суспензии E0771 с помощью ручной пипетки переложите 100 микролитров в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.
Затем добавьте равный объем раствора базальной мембраны и хорошо перемешайте, стараясь не вводить пузырьки. После этого держите трубку на льду. Наберите 100 микролитров клеточной суспензии в инсулиновый шприц 28-го калибра объемом 0,5 миллилитра U-100 и держите на льду.
С помощью щипцов подтяните кожу и аккуратно захватите и обнажите левый жировой мешок молочной железы. Затем введите 50 микролитров клеточной суспензии в жировую подушку молочной железы и подождите от трех до пяти секунд, прежде чем извлечь шприц. Затем освободите кожу от щипцов, позволив ей естественным образом вернуться в нормальное положение, и закройте разрез кожи, наложив скобки.
Чтобы контролировать рост ортотопического опухолевого поражения молочной железы, измеряйте длину и ширину первичной опухоли с помощью штангенциркуля три раза в неделю. После обезболивания введите 40 микролитров мелоксикама подкожно для контроля боли, а затем поместите мышь в положение лежа на спине. Затем при необходимости удалите предыдущие хирургические скобы и очистите брюшную полость 70% этанолом и раствором повидон-йода.
С помощью ножниц сделайте небольшой разрез по средней линии через кожу живота на уровне четвертой молочной ткани, обнажая, но не проникая через нижележащую брюшину. Затем удалите ортотопическую опухоль, разрезав с помощью ножниц нормальную ткань молочной железы, расположенную проксимально и дистально к опухоли. Выбросьте опухолевую ткань в пакет с биологической опасностью, повторяя процедуру с контралатеральной опухолью.
Затем закройте место операции с помощью одного-трех скоб и переложите мышь в чистую клетку для восстановления с теплой грелкой под ней. Вводите животным 100 микролитров раствора D-люциферина с помощью ретроорбитальной инъекции, вводя иглу в медиальный кантус глаза под углом 45 градусов от носа до тех пор, пока не почувствуется костное сопротивление, гарантируя, что игла будет помещена в ретроорбитальный венозный синус. Подтвердите успешную инъекцию отсутствием смыва жидкости после доставки и подождите две минуты перед визуализацией.
Во время ожидания переложите животных к носовым конусам, расположенным внутри биолюминесцентного тепловизора в лежачем положении. Чтобы измерить поток фотонов, создайте квадратный ROI для каждого животного, изображенного на изображении, в раскрывающемся меню инструмента ROI, нажав квадратную кнопку ROI. Переместите автоматически сгенерированный ROI на грудную клетку каждого животного, щелкнув и перетащив мышь.
А затем нажмите кнопку «Измерить ROI». Сделайте разрез по средней линии ниже мечевидного отростка, разрезая кожу, мускулатуру и брюшину, чтобы обнажить нижнюю часть грудной полости с помощью ножниц, пока диафрагма не станет видна. После этого проколите диафрагму, чтобы разрушить легкие, а затем разрежьте диафрагму.
Разрежьте грудную клетку с правой и левой стороны, а затем с помощью гемостата захватите мечевидный отросток и отодвиньте грудную клетку в сторону, обнажив сердце и легкие. Далее с помощью ножниц обрежьте правое предсердие. Затем перфузируйте животное 10 миллилитрами ледяного PBS через левый желудочек и оцените полноту перфузии, убедившись, что жидкость, вытекающая из правого предсердия, становится прозрачной, а печень приобретает бледно-желтый цвет.
Далее определите трахею и введите игольчатый шприц 22-го калибра с тремя миллилитрами 4% параформальдегида, держа его параллельно трахее. Затем подавайте раствор в медленном темпе до тех пор, пока легкие полностью не надутся. Продолжайте осторожно удерживать трахею.
Отрежьте его ножницами над щипцами и начните осторожно приподнимать ткань, удаляя при этом всю соединительную ткань. Затем препарируйте сердце вдали от легких. После этого поместите легочную ткань в 4% параформальдегид в PBS на ночь и храните при температуре четыре градуса Цельсия для фиксации.
При использовании мышей C57 black 6 значительный сигнал биолюминесценции метастазирования в легкие обычно обнаруживается примерно через две недели после первичной резекции опухоли и может наблюдаться в течение некоторого времени, хотя могут быть обнаружены некоторые вариации в зависимости от типа репортера люциферазы и штамма мыши. Биолюминесцентная визуализация легочной ткани ex vivo в конечной точке обеспечивает точную и чувствительную количественную оценку метастатической нагрузки в легкие, которую можно построить для сравнения с другими методами лечения. Подсчет узелков в легких под стереоскопом и гистологический анализ гематоксилина и эозина могут быть использованы в дополнение к количественным исследованиям.
Небольшая задержка вывода иглы после введения жировой подушки молочной железы позволяет матричному раствору превратиться в гель, что является ключом к предотвращению утечки клеточной суспензии и развития экстра-маммарных опухолей. В настоящее время мы используем этот метод в сочетании с различными генетическими моделями мышей с нокаутом и нокаутом для дальнейшего изучения метастатического каскада, в частности, развития преметастатической ниши.
