Inzwischen ist bekannt, dass die systemischen Effekte von Primärtumoren eine bedeutende Rolle im Prozess der metastasierenden Dissemination spielen. Dies wird jedoch in experimentellen Metastasenassays oft übersehen. Dieses Modell soll den Forschern eine Möglichkeit bieten, diesen Effekt zu bewerten.
Dieses Protokoll beinhaltet die Beurteilung der spontanen Metastasierung nach chirurgischer Entfernung eines Primärtumors, die klinisch relevant ist. Vor allem nutzt es auch die Vorteile der Biolumineszenz-Bildgebung, um das Wachstum von Lungenmetastasen in Echtzeit zu überwachen. Dieser Versuchsaufbau kann erweitert werden, um pharmakologische oder genetische Interventionen bei Brustkrebs im neoadjuvanten Setting sowie die Relevanz spezifischer Signalwege im Metastasierungsprozess zu evaluieren.
Zu Beginn ernten Sie die Zellen, indem Sie das Zellkulturmedium aspirieren und mit sterilem PBS waschen. Anschließend mit zwei Millilitern 0,25%iger Trypsin-EDTA-Lösung etwa zwei bis drei Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, bis sich die Zellen lösen, und dann mit acht Millimetern vollständigem Medium waschen, um die Reaktion zu löschen. Nach dem Aspirieren des Überstands und dem Waschen der Zellen mit PBS resuspendieren Sie die Zellen in PBS in dem berechneten Volumen, das erforderlich ist, um die Zellen auf 6 Millionen Zellen pro Milliliter zu verdünnen.
Übertragen Sie dann die Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie sie bis zur Injektion auf Eis auf. Rasieren Sie die Haare am Bauch der anästhesierten Maus mit einer elektrischen Haarschneidemaschine und bringen Sie sie dann in Rückenlage. Reinigen Sie anschließend die vorbereitete Bauchregion mit 70% Ethanol und Povidon-Jod-Lösung.
Machen Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt durch die Bauchhaut auf Höhe des vierten Brustgewebes, der das darunter liegende Bauchfell freilegt, aber nicht durchdringt. Halten Sie dann die Haut mit einer Pinzette vom Bauchfell fern und trennen Sie die Haut mit sterilen, in Kochsalzlösung getauchten Wattestäbchen vom Bauchfell, indem Sie sich seitlich bewegen, um das rechte Brustfettpolster freizulegen, und wiederholen Sie dies auf der linken Seite, um das linke Brustfettpolster freizulegen. Nach dem Resuspendieren der E0771-Zellsuspension mit einer manuellen Pipette werden 100 Mikroliter in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Fügen Sie dann ein gleiches Volumen der Basalmembranmatrixlösung hinzu und mischen Sie gut, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen. Lassen Sie die Tube anschließend auf Eis. Ziehen Sie 100 Mikroliter Zellsuspension in eine 28-Gauge-Insulinspritze mit 0,5 Millilitern und halten Sie sie auf Eis.
Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an und greifen Sie vorsichtig nach dem Fettpolster der linken Brust, und legen Sie es frei. Injizieren Sie anschließend 50 Mikroliter Zellsuspension in das Brustfettpolster und warten Sie drei bis fünf Sekunden, bevor Sie die Spritze entfernen. Lösen Sie dann die Haut von der Pinzette, so dass sie auf natürliche Weise in ihre normale Position zurückkehren kann, und schließen Sie den Hautschnitt, indem Sie Hautklammern auftragen.
Um das Wachstum der orthotopen Brusttumorläsion zu überwachen, messen Sie die Länge und Breite des Primärtumors dreimal pro Woche mit Messschiebern. Verabreichen Sie nach der Anästhesie 40 Mikroliter Meloxicam subkutan zur Schmerzkontrolle und bringen Sie die Maus dann in Rückenlage. Entfernen Sie anschließend bei Bedarf vorherige chirurgische Klammern und reinigen Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol und Povidon-Jod-Lösung.
Machen Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt durch die Bauchhaut auf Höhe des vierten Brustgewebes, der das darunter liegende Bauchfell freilegt, aber nicht durchdringt. Entfernen Sie dann den orthotopen Tumor, indem Sie mit einer Schere das normale Brustgewebe durchschneiden, das sich proximal und distal zum Tumor befindet. Entsorgen Sie das Tumorgewebe in einen Biohazard-Beutel, während Sie den Eingriff mit dem kontralateralen Tumor wiederholen.
Als nächstes verschließen Sie die Operationsstelle mit ein bis drei Klammern und bringen Sie die Maus in einen sauberen Aufwachkäfig mit einem warmen Heizkissen darunter. Injizieren Sie den Tieren 100 Mikroliter D-Luciferin-Lösung unter Verwendung einer retroorbitalen Injektion, indem Sie die Nadel in einem 45-Grad-Winkel von der Nase in den medialen Canthus des Auges einführen, bis ein knöcherner Widerstand zu spüren ist, wobei Sie sicherstellen, dass die Nadel in der retroorbitalen Venenhöhle platziert wird. Bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion durch das Fehlen einer Rückspülung der Flüssigkeit bei der Verabreichung und warten Sie zwei Minuten, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen.
Setzen Sie die Tiere während des Wartens in Rückenlage in die Nasenkegel um, die sich im biolumineszierenden Imager befinden. Um den Photonenfluss zu messen, erstellen Sie einen quadratischen ROI für jedes Tier, das im Bild dargestellt ist, unter dem Dropdown-Menü des ROI-Tools, indem Sie auf die quadratische ROI-Schaltfläche klicken. Positionieren Sie den automatisch generierten ROI über dem Brustkorb jedes Tieres, indem Sie mit der Maus klicken und ziehen.
Klicken Sie dann auf die Schaltfläche ROI messen. Machen Sie einen Mittellinienschnitt unterhalb des Xiphoid-Prozesses und schneiden Sie durch die Haut, die Muskulatur und das Bauchfell, um den unteren Teil der Brusthöhle mit einer Schere freizulegen, bis das Zwerchfell sichtbar ist. Durchstechen Sie anschließend das Zwerchfell, um die Lunge zu kollabieren, und durchtrennen Sie dann das Zwerchfell.
Schneiden Sie den Brustkorb auf der rechten und linken Seite durch und verwenden Sie dann ein Blutstillungsmittel, um den Xiphoid-Prozess zu erfassen und den Brustkorb aus dem Weg zu räumen, wodurch Herz und Lunge freigelegt werden. Schneiden Sie anschließend den rechten Vorhof mit einer Schere ab. Dann perfundieren Sie das Tier mit 10 Millilitern eiskaltem PBS durch den linken Ventrikel und beurteilen Sie die Vollständigkeit der Perfusion, indem Sie bestätigen, dass die aus dem rechten Vorhof fließende Flüssigkeit klar wird und die Leber eine blassgelbe Farbe annimmt.
Identifizieren Sie als Nächstes die Luftröhre und führen Sie eine 22-Gauge-Nadelspritze mit drei Millilitern 4%-Paraformaldehyd ein und halten Sie sie parallel zur Luftröhre. Geben Sie dann die Lösung in einem langsamen Tempo ab, bis sich die Lunge vollständig aufgebläht hat. Halten Sie die Luftröhre weiterhin sanft fest.
Schneiden Sie es mit einer Schere über der Pinzette ab und beginnen Sie vorsichtig, das Gewebe anzuheben, während Sie das gesamte Bindegewebe entfernen. Präparieren Sie als Nächstes das Herz von der Lunge weg. Legen Sie anschließend Lungengewebe über Nacht in 4%-Paraformaldehyd in PBS und lagern Sie es zur Fixierung bei vier Grad Celsius.
Unter Verwendung von C57 Black 6-Mäusen wird ein signifikantes Lungenmetastasen-Biolumineszenzsignal in der Regel etwa zwei Wochen nach der Resektion des Primärtumors nachgewiesen und kann im Laufe der Zeit verfolgt werden, obwohl je nach Luciferase-Reportertyp und Mausstamm einige Unterschiede festgestellt werden können. Die ex vivo Biolumineszenz-Bildgebung des Lungengewebes am Endpunkt ermöglicht eine genaue und empfindliche Quantifizierung der metastasierten Belastung der Lunge, die zum Vergleich mit anderen Behandlungen aufgetragen werden kann. Die Lungenknotenzählung unter dem Stereoskop und die histologische Analyse von Hämatoxylin- und Eosinen können zur Ergänzung der Quantifizierungsstudien verwendet werden.
Durch eine leichte Verzögerung der Nadelentnahme nach der Injektion von Brustfettpolstern kann die Matrixlösung gelieren, was der Schlüssel ist, um das Austreten der Zellsuspension und die Entwicklung von extramammären Tumoren zu verhindern. Wir nutzen diese Technik nun in Kombination mit verschiedenen genetischen Knockout- und Knockin-Mausmodellen, um die Metastasierungskaskade weiter zu untersuchen, insbesondere die Entwicklung der prämetastasierten Nische.
