体内研究 影像学检查测量原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

原发性肿瘤的全身效应现在被认为在转移播散过程中起着重要作用。然而，这在实验性转移分析中经常被遗漏。该模型旨在为研究人员提供一种评估这种效果的方法。

该方案包括手术切除原发性肿瘤后自发转移的评估，这是临床相关的。主要是，它还利用生物发光成像来实时监测肺转移的生长。该实验设置可以扩展为评估新辅助治疗中乳腺癌的药物或遗传干预，以及特定信号通路在转移过程中的相关性。

首先，通过吸出细胞培养基收获细胞并用无菌 PBS 洗涤。接下来，在 37 摄氏度下与 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液孵育约 2 至 3 分钟，直至细胞分离，然后用 8 毫米完全培养基洗涤以淬灭反应。吸出上清液并用 PBS 洗涤细胞后，将细胞重悬于 PBS 中，体积达到将细胞稀释至 600 万个细胞/毫升所需的体积。

然后将细胞悬液转移到 1.5 mL 微量离心管中，并保持在冰上直至准备好注射。用电动剪刀剃掉麻醉小鼠腹部的毛发，然后将其置于仰卧位。接下来，使用 70% 乙醇和聚维酮碘溶液清洁准备好的腹部区域。

使用剪刀，在第四乳腺组织水平的腹部皮肤上做一个小的中线切口，露出但不穿透下面的腹膜。然后用镊子将皮肤远离腹膜，用无菌盐水蘸有棉签的棉签将皮肤与腹膜分开，横向移动以露出右侧乳腺脂肪垫，并在左侧重复以露出左侧乳腺脂肪垫。使用手动移液器重悬 E0771 细胞悬液后，将 100 μL 转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。

然后加入等体积的基底膜基质溶液并充分混合，注意不要引入气泡。之后，将试管保持在冰上。将 100 微升细胞悬液吸入 28 号 0.5 毫升 U-100 胰岛素注射器中，并保持在冰上。

使用镊子提起皮肤，轻轻抓住并露出左侧乳腺脂肪垫。接下来，将 50 微升细胞悬液注射到乳腺脂肪垫中，等待 3 到 5 秒，然后再取出注射器。然后从镊子中释放皮肤，使其自然恢复到正常位置，并关闭皮肤切口，使用皮肤缝合器。

为了监测原位乳腺肿瘤病变的生长，使用卡尺每周 3 次测量原发肿瘤的长度和宽度。麻醉后，皮下注射 40 微升美洛昔康以控制疼痛，然后将鼠标置于仰卧位。接下来，如有必要，去除先前的手术缝合器，并用 70% 乙醇和聚维酮碘溶液清洁腹部。

使用剪刀，在第四乳腺组织水平的腹部皮肤上做一个小的中线切口，露出但不穿透下面的腹膜。然后用剪刀切开位于肿瘤近端和远端的正常乳腺组织，切除原位肿瘤。将肿瘤组织丢弃到生物危害袋中，同时对对侧肿瘤重复该过程。

接下来，使用一到三个订书钉关闭手术部位，然后将鼠标转移到干净的恢复笼中，下面有一个温暖的加热垫。使用眶后注射向动物注射 100 微升 D-荧光素溶液，方法是将针头以与鼻子成 45 度角插入眼睛的内眦中，直到感觉到骨阻力，确保针头放置在眶后静脉窦内。通过输送时没有回流任何液体来确认注射成功，并等待两分钟后再进行成像。

等待时，将动物以仰卧姿势转移到位于生物发光成像仪内的鼻锥上。要测量光子通量，请单击方形 ROI 按钮，从 ROI 工具的下拉菜单下为图像中描绘的每只动物创建一个方形 ROI。通过单击并拖动鼠标，将自动生成的 ROI 重新定位在每只动物的胸部上。

然后单击衡量 ROI 的按钮。在剑突下方做一个中线切口，切开皮肤、肌肉组织和腹膜，用剪刀露出胸腔的下部，直到看到横膈膜。之后，刺穿横膈膜以使肺部塌陷，然后切开横膈膜。

切开左右两侧的胸腔，然后用止血钳抓住剑突，将胸腔移开，露出心脏和肺部。接下来，用剪刀剪掉右心房。然后通过左心室用 10 毫升冰冷的 PBS 灌注动物，并通过确认从右心房流出的液体变得清澈，肝脏变成淡黄色来评估灌注的完整性。

接下来，识别气管并插入一个装有 3 毫升 4% 多聚甲醛的 22 号针头注射器，使其与气管平行。然后以缓慢的速度输送溶液，直到肺部完全充气。继续轻轻握住气管。

用镊子上方的剪刀剪住它，然后开始小心地提起组织，同时去除所有结缔组织。接下来，将心脏从肺部解剖出来。之后，将肺组织置于 PBS 中的 4% 多聚甲醛中过夜，并在 4 摄氏度下储存固定。

利用 C57 黑色 6 小鼠，通常在原发性肿瘤切除后两周左右检测到显着的肺转移生物发光信号，并且可以随着时间的推移进行随访，尽管根据荧光素酶报告基因类型和小鼠品系可以发现一些变化。终点肺组织的离体生物发光成像提供了准确和灵敏的肺转移负荷定量，可以绘制成与其他治疗方法进行比较。立体镜下的肺结节计数以及苏木精和伊红组织学分析可用于补充定量研究。

乳腺脂肪垫注射后略微延迟针头拔出可使基质溶液凝胶化，这是防止细胞悬液渗漏和乳腺外肿瘤发展的关键。我们现在正在将这项技术与各种基因敲除和敲入小鼠模型相结合，以进一步研究转移级联反应，特别是转移前生态位的发展。