ההשפעות המערכתיות של גידולים ראשוניים מוכרות כיום כממלאות תפקיד משמעותי בתהליך ההפצה הגרורתית. עם זאת, זה מתפספס לעתים קרובות בבדיקות גרורות ניסיוניות. מודל זה נועד לספק לחוקרים דרך להעריך השפעה זו.
פרוטוקול זה כולל הערכה של גרורות ספונטניות לאחר הסרה כירורגית של גידול ראשוני, הרלוונטי מבחינה קלינית. בעיקר, הוא גם מנצל את ההדמיה של ביולומינסנציה כדי לעקוב אחר צמיחת גרורות ריאה בזמן אמת. ניתן להרחיב מערך ניסויי זה כדי להעריך התערבויות פרמקולוגיות או גנטיות לסרטן השד בסביבה הניאו-אדג'ובנטית, כמו גם את הרלוונטיות של מסלולי איתות ספציפיים בתהליך גרורתי.
כדי להתחיל, קצרו את התאים על ידי שאיפת מדיום תרבית התאים ושטפו עם PBS סטרילי. לאחר מכן, לדגור עם שני מיליליטר של 0.25% תמיסת טריפסין-EDTA במשך שתיים עד שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתנתקים ולאחר מכן לשטוף עם שמונה מילימטרים של תווך מלא כדי להרוות את התגובה. לאחר שאיפת הסופרנאטנט ושטיפת התאים עם PBS, יש להשהות מחדש את התאים ב-PBS בנפח המחושב הדרוש כדי לדלל תאים ל-6 מיליון תאים למיליליטר.
לאחר מכן מעבירים את תרחיף התא לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מיליליטר, ושומרים על קרח עד שהוא מוכן להזרקה. לגלח את השיער על הבטן של העכבר מורדם באמצעות קוצץ חשמלי, ולאחר מכן להניח אותו במצב שכיבה. לאחר מכן, לנקות את אזור הבטן מוכן באמצעות 70% אתנול ו povidone-יוד פתרון.
בעזרת מספריים, לבצע חתך קטן קו האמצע דרך עור הבטן ברמה של רקמת החלב הרביעית, לחשוף אך לא חודר דרך הצפק הבסיסי. לאחר מכן החזיקו את העור הרחק מהצפק באמצעות מלקחיים והפרידו את העור מהצפק באמצעות מקלוני צמר גפן סטריליים טבולים במי מלח, נעים לרוחב כדי לחשוף את כרית שומן החלב הימנית, וחזרו על הפעולה בצד שמאל כדי לחשוף את כרית שומן החלב השמאלית. לאחר השעיה מחדש של תרחיף התאים E0771 באמצעות פיפטה ידנית, העבר 100 מיקרוליטר לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן להוסיף נפח שווה של פתרון מטריצת קרום מרתף ולערבב היטב, נזהר לא להציג בועות. לאחר מכן, שמור את הצינור על קרח. משכו 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך מזרק אינסולין U-100 בעל 28 מד 0.5 מיליליטר, ושמרו על קרח.
בעזרת מלקחיים, הרימו את העור ותפסו וחשפו בעדינות את כרית שומן החלב השמאלית. לאחר מכן, הזריקו 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך כרית שומן החלב והמתינו שלוש עד חמש שניות לפני הסרת המזרק. לאחר מכן שחררו את העור מהמלקחיים, ואפשרו לו לחזור באופן טבעי למקומו הרגיל, וסגרו את חתך העור, תוך החלת סיכות עור.
כדי לעקוב אחר צמיחת הנגע האורתוטופי בגידול השד, יש למדוד את אורך הגידול הראשוני ורוחבו באמצעות קליפרים שלוש פעמים בשבוע. לאחר הרדמה, לנהל 40 מיקרוליטר של meloxicam תת עורית עבור שליטה בכאב, ולאחר מכן להניח את העכבר במצב שכיבה. לאחר מכן, להסיר סיכות כירורגיות קודמות במידת הצורך, ולנקות את הבטן עם 70% אתנול ותמיסת פובידון-יוד.
בעזרת מספריים, לבצע חתך קטן קו האמצע דרך עור הבטן ברמה של רקמת החלב הרביעית, לחשוף אך לא חודר דרך הצפק הבסיסי. לאחר מכן להסיר את הגידול האורתוטופי על ידי חיתוך דרך רקמת החלב הרגילה, הממוקם בסמיכות ו distally לגידול באמצעות מספריים. יש להשליך את רקמת הגידול לשקית מסוכנת ביולוגית תוך חזרה על ההליך עם הגידול הנגדי.
לאחר מכן, סגור את אתר הניתוח באמצעות אחד עד שלושה סיכות והעבר את העכבר לכלוב התאוששות נקי עם כרית חימום חמה מתחת. הזריקו לבעלי החיים 100 מיקרוליטר של תמיסת D-לוציפרין באמצעות הזרקה רטרואורביטלית על ידי החדרת המחט לקנטוס המדיאלי של העין בזווית של 45 מעלות מהאף עד שתורגש התנגדות גרמית, ויבטיחו שהמחט ממוקמת בתוך הסינוס הוורידי הרטרואורביטלי. יש לוודא הזרקה מוצלחת על ידי חוסר שטיפה של נוזל כלשהו עם הלידה ולהמתין שתי דקות לפני ההדמיה.
בזמן ההמתנה, העבירו את בעלי החיים לקונוסים הממוקמים בתוך ההדמיה הביו-לומינסנטית במצב שכיבה. כדי למדוד את שטף הפוטון, צור החזר השקעה ריבועי עבור כל חיה המתוארת בתמונה מתחת לתפריט הנפתח של הכלי ROI על-ידי לחיצה על לחצן החזר ההשקעה הריבועי. מקם מחדש את החזר ההשקעה שנוצר באופן אוטומטי על בית החזה של כל חיה על ידי לחיצה וגרירה עם העכבר.
ולאחר מכן לחץ על לחצן החזר ההשקעה. בצע חתך קו אמצע מתחת לתהליך xiphoid, חיתוך דרך העור, השרירים והצפק כדי לחשוף את החלק התחתון של חלל החזה באמצעות מספריים עד הסרעפת גלוי. לאחר מכן, נקב את הסרעפת כדי למוטט את הריאות ולאחר מכן לחתוך דרך הסרעפת.
חתכו דרך כלוב הצלעות בצד ימין ושמאל, ולאחר מכן השתמשו בהמוסאט כדי לתפוס את תהליך הקסיפואיד ולהזיז את כלוב הצלעות מהדרך, תוך חשיפת הלב והריאות. לאחר מכן, לחתוך את אטריום ימין באמצעות מספריים. לאחר מכן לנקב את החיה עם 10 מיליליטר של PBS קר כקרח דרך החדר השמאלי, ולהעריך את שלמות הזילוח על ידי אישור כי נוזל זורם מן אטריום ימין הופך ברור וכי הכבד הופך צבע צהוב חיוור.
לאחר מכן, לזהות את קנה הנשימה ולהכניס מזרק מחט 22 מד עם שלושה מיליליטר של 4% paraformaldehyde, מחזיק אותו במקביל קנה הנשימה. לאחר מכן לספק את הפתרון בקצב איטי עד שהריאות מנופחות לחלוטין. המשיכו להחזיק בעדינות את קנה הנשימה.
חותכים אותו עם מספריים מעל המלקחיים ומתחילים להרים בזהירות את הרקמה תוך הסרת כל רקמת החיבור. לאחר מכן, לנתח את הלב הרחק מן הריאות. לאחר מכן, הניחו את רקמת הריאה ב-4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך הלילה ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס לצורך קיבוע.
באמצעות C57 עכברים שחורים 6, אות ביולומינסנציה משמעותי של גרורות ריאה מזוהה בדרך כלל כשבועיים לאחר כריתת הגידול הראשונית וניתן לעקוב אחריו לאורך זמן, אם כי ניתן למצוא שונות מסוימת בהתאם לסוג כתב לוציפראז וזן העכבר. ההדמיה הביולומינסצנטית ex vivo של רקמת הריאה בנקודת הקצה מספקת כימות מדויק ורגיש של עומס גרורתי ריאתי שניתן להשוותו לטיפולים אחרים. ספירת קשריות ריאה תחת הסטריאוסקופ וניתוח היסטולוגי של המטוקסילין ואאוזין יכולה לשמש כהשלמה למחקרי הכימות.
עיכוב קל של נסיגת המחט לאחר הזרקת כרית שומן החלב מאפשר לתמיסת המטריקס לג'ל, שהוא המפתח למניעת דליפה של תרחיף התא והתפתחות גידולים חוץ-חלביים. כעת אנו משתמשים בטכניקה זו בשילוב עם מודלים גנטיים שונים של נוקאאוט ועכבר נוקין כדי להמשיך ולחקור את המפל הגרורתי, במיוחד את התפתחות הנישה הקדם-גרורתית.
