Ahora se reconoce que los efectos sistémicos de los tumores primarios desempeñan un papel importante en el proceso de diseminación metastásica. Sin embargo, esto a menudo se pasa por alto en los ensayos experimentales de metástasis. Este modelo tiene como objetivo proporcionar a los investigadores una forma de evaluar este efecto.
Este protocolo incluye la evaluación de la metástasis espontánea después de la extirpación quirúrgica de un tumor primario, que es clínicamente relevante. Principalmente, también aprovecha las imágenes de bioluminiscencia para monitorear el crecimiento de metástasis pulmonares en tiempo real. Esta configuración experimental puede extenderse para evaluar las intervenciones farmacológicas o genéticas para el cáncer de mama en el entorno neoadyuvante, así como la relevancia de vías de señalización específicas en el proceso metastásico.
Para empezar, recoja las células aspirando el medio de cultivo celular y lávelas con PBS estéril. A continuación, incubar con dos mililitros de solución de tripsina-EDTA al 0,25% durante unos dos o tres minutos a 37 grados centígrados hasta que las células se desprendan y luego lavar con ocho milímetros de medio completo para apagar la reacción. Después de aspirar el sobrenadante y lavar las células con PBS, vuelva a suspender las células en PBS en el volumen calculado necesario para diluir las células a 6 millones de células por mililitro.
A continuación, transfiera la suspensión de la célula a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y manténgala en hielo hasta que esté lista para la inyección. Afeitar el pelo del abdomen del ratón anestesiado con una maquinilla eléctrica y luego colocarlo en posición supina. A continuación, limpie la región abdominal preparada con una solución de etanol al 70% y povidona yodada.
Con unas tijeras, haga una pequeña incisión en la línea media a través de la piel abdominal a nivel del cuarto tejido mamario, exponiendo pero no penetrando a través del peritoneo subyacente. A continuación, mantenga la piel alejada del peritoneo con pinzas y separe la piel del peritoneo con hisopos de algodón estériles sumergidos en solución salina, moviéndose lateralmente para exponer la almohadilla de grasa mamaria derecha, y repita en el lado izquierdo para exponer la almohadilla de grasa mamaria izquierda. Después de volver a suspender la suspensión de celdas E0771 con una pipeta manual, transfiera 100 microlitros a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Luego agregue un volumen igual de solución de matriz de membrana basal y mezcle bien, teniendo cuidado de no introducir burbujas. Después, mantenga el tubo en hielo. Extraiga 100 microlitros de suspensión celular en una jeringa de insulina U-100 de 0,5 mililitros de calibre 28 y manténgala en hielo.
Con pinzas, levante la piel y agarre y exponga suavemente la almohadilla de grasa mamaria izquierda. A continuación, inyecte 50 microlitros de suspensión celular en la almohadilla de grasa mamaria y espere de tres a cinco segundos antes de retirar la jeringa. A continuación, suelte la piel de las pinzas, permitiendo que vuelva naturalmente a su posición normal, y cierre la incisión cutánea, aplicando grapas cutáneas.
Para controlar el crecimiento de la lesión tumoral de mama ortotópica, mida la longitud y la anchura del tumor primario con calibradores tres veces por semana. Después de anestesiar, administre 40 microlitros de meloxicam por vía subcutánea para el control del dolor y luego coloque al ratón en posición supina. A continuación, retire las grapas quirúrgicas anteriores si es necesario y limpie el abdomen con una solución de etanol al 70% y povidona yodada.
Con unas tijeras, haga una pequeña incisión en la línea media a través de la piel abdominal a nivel del cuarto tejido mamario, exponiendo pero no penetrando a través del peritoneo subyacente. A continuación, extirpa el tumor ortotópico cortando el tejido mamario normal, situado proximal y distalmente al tumor, con unas tijeras. Deseche el tejido tumoral en una bolsa de riesgo biológico mientras repite el procedimiento con el tumor contralateral.
A continuación, cierre el sitio quirúrgico con una a tres grapas y transfiera el mouse a una jaula de recuperación limpia con una almohadilla térmica tibia debajo. Inyectar a los animales 100 microlitros de solución de D-luciferina mediante una inyección retroorbitaria insertando la aguja en el canto medial del ojo en un ángulo de 45 grados desde la nariz hasta que se sienta la resistencia ósea, asegurándose de que la aguja se coloque dentro del seno venoso retroorbitario. Confirme el éxito de la inyección por la falta de lavado de cualquier líquido en el momento de la entrega y espere dos minutos antes de la toma de imágenes.
Mientras espera, transfiera a los animales a los conos de la nariz ubicados dentro del generador de imágenes bioluminiscentes en posición supina. Para medir el flujo de fotones, cree un ROI cuadrado para cada animal representado en la imagen desde el menú desplegable de la herramienta ROI haciendo clic en el botón ROI cuadrado. Vuelva a colocar el ROI generado automáticamente sobre el tórax de cada animal haciendo clic y arrastrando con el ratón.
Y luego haga clic en el botón medir el ROI. Haga una incisión en la línea media por debajo de la apófisis xifoides, cortando la piel, la musculatura y el peritoneo para exponer la parte inferior de la cavidad torácica con unas tijeras hasta que el diafragma sea visible. Después, perfore el diafragma para colapsar los pulmones y luego corte a través del diafragma.
Corta a través de la caja torácica en el lado derecho e izquierdo, y luego usa un hemostático para agarrar la apófisis xifoides y mover la caja torácica fuera del camino, exponiendo el corazón y los pulmones. A continuación, corta la aurícula derecha con unas tijeras. A continuación, perfundir al animal con 10 mililitros de PBS helado a través del ventrículo izquierdo y evaluar la integridad de la perfusión confirmando que el líquido que fluye de la aurícula derecha se vuelve transparente y que el hígado adquiere un color amarillo pálido.
A continuación, identifique la tráquea e inserte una jeringa de aguja de calibre 22 con tres mililitros de paraformaldehído al 4%, sosteniéndola paralela a la tráquea. A continuación, administre la solución a un ritmo lento hasta que los pulmones se hayan inflado por completo. Continúe sosteniendo suavemente la tráquea.
Córtalo con unas tijeras por encima de las pinzas y comienza a levantar con cuidado el tejido mientras retiras todo el tejido conectivo. A continuación, disecciona el corazón lejos de los pulmones. Posteriormente, coloque el tejido pulmonar en paraformaldehído al 4% en PBS durante la noche y almacene a cuatro grados centígrados para su fijación.
Utilizando ratones C57 black 6, la señal significativa de bioluminiscencia de metástasis pulmonar generalmente se detecta alrededor de dos semanas después de la resección del tumor primario y se puede seguir a lo largo del tiempo, aunque se pueden encontrar algunas variaciones según el tipo de indicador de luciferasa y la cepa del ratón. Las imágenes de bioluminiscencia ex vivo del tejido pulmonar en el punto final proporcionan una cuantificación precisa y sensible de la carga metastásica pulmonar que se puede trazar para compararla con otros tratamientos. El recuento de nódulos pulmonares bajo el estereoscopio y el análisis histológico de hematoxilina y eosina se pueden utilizar para complementar los estudios de cuantificación.
Retrasar ligeramente la retirada de la aguja después de la inyección de la almohadilla de grasa mamaria permite que la solución de la matriz se gelifique, lo cual es clave para evitar la fuga de la suspensión celular y el desarrollo de tumores extramamarios. Ahora estamos utilizando esta técnica en combinación con varios modelos genéticos de ratones knockout y knockin para estudiar más a fondo la cascada metastásica, en particular el desarrollo del nicho pre-metastásico.
