من المعترف الآن أن التأثيرات الجهازية للأورام الأولية تلعب دورا مهما في عملية الانتشار النقيلي. ومع ذلك ، غالبا ما يتم تفويت هذا في فحوصات ورم خبيث تجريبي. يهدف هذا النموذج إلى تزويد الباحثين بطريقة لتقييم هذا التأثير.
يتضمن هذا البروتوكول تقييم ورم خبيث تلقائي بعد الاستئصال الجراحي للورم الأولي ، وهو أمر مهم سريريا. بشكل أساسي ، فإنه يستفيد أيضا من التصوير الحيوي لمراقبة نمو ورم خبيث في الرئة في الوقت الفعلي. يمكن توسيع هذا الإعداد التجريبي لتقييم التدخلات الدوائية أو الجينية لسرطان الثدي في بيئة المساعدة الجديدة ، بالإضافة إلى أهمية مسارات إشارات محددة في العملية النقيلية.
للبدء ، قم بحصاد الخلايا عن طريق شفط وسط زراعة الخلايا وغسلها باستخدام PBS المعقم. بعد ذلك ، احتضن بملليلترين من محلول 0.25٪ Trypsin-EDTA لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا ثم تغسل بثمانية ملليمترات من الوسط الكامل لإخماد التفاعل. بعد شفط المادة الطافية وغسل الخلايا باستخدام PBS ، أعد تعليق الخلايا في PBS في الحجم المحسوب اللازم لتخفيف الخلايا إلى 6 ملايين خلية لكل مليلتر.
ثم انقل معلق الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر ، واحتفظ بها على الثلج حتى تصبح جاهزة للحقن. احلق شعر البطن من الفأر المخدر باستخدام المقصات الكهربائية ، ثم ضعه في وضع ضعيف. بعد ذلك ، قم بتنظيف منطقة البطن المحضرة باستخدام 70٪ من الإيثانول ومحلول بوفيدون اليود.
باستخدام المقص ، قم بعمل شق صغير في خط الوسط عبر جلد البطن على مستوى النسيج الثديي الرابع ، مما يعرض الصفاق الأساسي ولكن لا يخترقه. ثم امسك الجلد بعيدا عن الصفاق باستخدام ملقط وافصل الجلد بعيدا عن الصفاق باستخدام مسحات قطنية معقمة مغموسة بالمحلول الملحي ، وتحرك بشكل جانبي لكشف وسادة دهون الثدي اليمنى ، وكرر ذلك على الجانب الأيسر لكشف وسادة دهون الثدي اليسرى. بعد إعادة تعليق نظام التعليق الخلوي E0771 باستخدام ماصة يدوية، انقل 100 ميكرولتر إلى أنبوب جديد لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر.
ثم أضف حجما متساويا من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي واخلطه جيدا ، مع الحرص على عدم إدخال الفقاعات. بعد ذلك ، احتفظ بالأنبوب على الجليد. اسحب 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في حقنة أنسولين U-100 عيار 28 سعة 0.5 ملليلتر ، واستمر في وضع الثلج.
باستخدام الملقط ، ارفع الجلد وامسك بلطف وكشف وسادة دهون الثدي اليسرى. بعد ذلك ، قم بحقن 50 ميكرولترا من تعليق الخلية في وسادة دهون الثدي وانتظر لمدة ثلاث إلى خمس ثوان قبل إزالة المحقنة. ثم حرر الجلد من الملقط ، مما يسمح له بالعودة بشكل طبيعي إلى وضعه الطبيعي ، وإغلاق شق الجلد ، وتطبيق دبابيس الجلد.
لمراقبة نمو آفة ورم الثدي التقويمي ، قم بقياس طول الورم الأساسي وعرضه باستخدام الفرجار ثلاث مرات في الأسبوع. بعد التخدير، قم بإعطاء 40 ميكرولترا من الميلوكسيكام تحت الجلد للسيطرة على الألم، ثم ضع الفأر في وضع ضعيف. بعد ذلك ، قم بإزالة الدبابيس الجراحية السابقة إذا لزم الأمر ، ونظف البطن بمحلول 70٪ من الإيثانول واليود.
باستخدام المقص ، قم بعمل شق صغير في خط الوسط عبر جلد البطن على مستوى النسيج الثديي الرابع ، مما يعرض الصفاق الأساسي ولكن لا يخترقه. ثم قم بإزالة الورم التقويمي عن طريق قطع الأنسجة الثديية الطبيعية ، الموجودة بالقرب من الورم وبعدها باستخدام المقص. تخلص من أنسجة الورم في كيس بيولوجي أثناء تكرار الإجراء مع الورم المقابل.
بعد ذلك ، أغلق موقع الجراحة باستخدام واحد إلى ثلاثة دبابيس وانقل الماوس إلى قفص انتعاش نظيف مع وسادة تسخين دافئة تحته. حقن ب 100 ميكرولتر من محلول D-luciferin باستخدام حقن خلف الحجاج عن طريق إدخال الإبرة في القناة الإنسية للعين بزاوية 45 درجة من الأنف حتى يتم الشعور بالمقاومة العظمية ، مما يضمن وضع الإبرة داخل الجيوب الأنفية الوريدية خلف الحجاج. تأكد من الحقن الناجح بسبب عدم وجود تدفق لأي سائل عند التسليم وانتظر دقيقتين قبل التصوير.
أثناء الانتظار ، انقل إلى مخاريط الأنف الموجودة داخل جهاز التصوير الحيوي في وضع ضعيف. لقياس تدفق الفوتون ، قم بإنشاء عائد استثمار مربع لكل موضح في الصورة من أسفل القائمة المنسدلة لأداة عائد الاستثمار بالنقر فوق الزر مربع عائد الاستثمار. أعد وضع عائد الاستثمار الذي يتم إنشاؤه تلقائيا فوق صدر كل عن طريق النقر والسحب بالماوس.
ثم انقر فوق زر قياس عائد الاستثمار. قم بعمل شق خط الوسط أسفل عملية الخنجري ، وقطع الجلد والعضلات والصفاق لكشف الجزء السفلي من التجويف الصدري باستخدام المقص حتى يصبح الحجاب الحاجز مرئيا. بعد ذلك ، قم بثقب الحجاب الحاجز لانهيار الرئتين ثم قطع الحجاب الحاجز.
اقطع القفص الصدري على الجانب الأيمن والأيسر ، ثم استخدم hemostat للاستيلاء على عملية الخنجري وتحريك القفص الصدري بعيدا عن الطريق ، مما يؤدي إلى تعريض القلب والرئتين. بعد ذلك ، قم بقص الأذين الأيمن باستخدام المقص. ثم قم بتنقية ب 10 ملليلتر من PBS المثلج من خلال البطين الأيسر ، وقم بتقييم اكتمال التروية من خلال التأكد من أن السائل المتدفق من الأذين الأيمن يتحول إلى اللون الأصفر الباهت.
بعد ذلك ، حدد القصبة الهوائية وأدخل حقنة إبرة قياس 22 مع ثلاثة ملليلتر من 4٪ بارافورمالدهايد ، مع تثبيتها بالتوازي مع القصبة الهوائية. ثم قم بتوصيل المحلول بوتيرة بطيئة حتى تنتفخ الرئتان بالكامل. استمر في إمساك القصبة الهوائية برفق.
قصها بالمقص فوق الملقط وابدأ في رفع الأنسجة بعناية أثناء إزالة كل النسيج الضام. بعد ذلك ، قم بتشريح القلب بعيدا عن الرئتين. بعد ذلك ، ضع أنسجة الرئة في 4٪ بارافورمالدهيد في PBS طوال الليل وخزنها على أربع درجات مئوية للتثبيت.
باستخدام C57 Black 6 الفئران ، عادة ما يتم اكتشاف إشارة تلألؤ بيولوجي كبير في ورم خبيث في الرئة بعد حوالي أسبوعين من استئصال الورم الأولي ويمكن متابعتها بمرور الوقت ، على الرغم من أنه يمكن العثور على بعض الاختلافات اعتمادا على نوع مراسل لوسيفيراز وإجهاد الفأر. يوفر التصوير الحيوي للتلألؤ الحيوي خارج الجسم الحي لأنسجة الرئة عند نقطة النهاية تقديرا كميا دقيقا وحساسا للعبء النقيلي للرئة الذي يمكن رسمه لمقارنته بالعلاجات الأخرى. يمكن استخدام عد عقيدات الرئة تحت المنظار المجسم والتحليل النسيجي للهيماتوكسيلين واليوزين لاستكمال دراسات القياس الكمي.
يسمح تأخير انسحاب الإبرة قليلا بعد حقن وسادة الدهون الثديية لمحلول المصفوفة بالهلام ، وهو أمر أساسي لمنع تسرب تعليق الخلية وتطور الأورام خارج الثدي. نحن نستخدم الآن هذه التقنية جنبا إلى جنب مع العديد من نماذج الضربة القاضية الجينية ونماذج الفأر الضربة لدراسة الشلال النقيلي ، لا سيما تطوير مكانة ما قبل النقيلية.
