Система анализа транскрипции in vitro для Borreliella burgdorferi предоставляет исследователям биохимический инструмент для изучения механизмов регуляции генов и факторов, которые управляют ферментативной активностью РНК-полимеразы. Система позволяет нам проверить, как факторы транскрипции, кофакторы, концентрации соли и рН влияют на функцию РНК-полимеразы Borreliella burgdorferi, что способствует нашему общему пониманию механизмов регуляции генов. Этот мощный метод также может позволить нам проводить скрининг лекарств, которые избирательно ингибируют РНК-полимеразу, открывая двери для разработки новых лекарств для лечения боррелиоза Лайма.
Для начала соберите клеточный гранул от двух до четырех литров Borreliella burgdorferi RpoC-His10X, культивируемого в среде BSKII в микроаэрофильной среде, до плотности в два-четыре раза по 10 констант на миллилитр. Гранулируйте ячейки в 10 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия в центробежных бутылках объемом 500 миллилитров и выбросьте надосадочную жидкость. Затем ресуспендируйте клетки в 30 миллилитрах ледяного буфера HN, повторите этап центрифугирования и сцедите надосадочную жидкость.
Во время работы поддерживайте клетки, лизат и очищенные белки при температуре четыре градуса Цельсия или на льду, если вы не замораживаете. Сохраняйте РНК-полимеразу в восстановительной среде, добавляя свежеприготовленный дитиотреитол в концентрации два миллимоля в каждый используемый буфер, и поддерживайте pH 8,0. Приготовьте лизат из клеточных гранул Borreliella burgdorferi, используя коммерческий набор для лизиса бактерий.
Ресуспендируйте гранулу в 10-15 миллилитрах раствора B-PER без ингибитора протеазы и дайте лизису продолжаться в течение пяти минут на льду. Добавьте коктейль ингибитора протеазы в раствор лизиса и проведите три раунда обработки ультразвуком. Теперь осветлить лизат клетки центрифугированием и фильтрацией с помощью 50-миллилитровой центрифужной пробирки.
Добавьте в раствор буфер загрузки кобальтовой колонны, доведя общий объем до 30 миллилитров. Гранулируйте клеточный мусор центрифугированием в 20 000 раз G в течение 30 минут. Позже отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью шприцевого фильтра размером 0,45 микрометра и разбавьте буфер загрузки колонки лизата и кобальта до конечного соотношения разбавления 1:10.
Выполните аффинную хроматографию на супернатанте осветленного клеточного лизата с помощью колонки из кобальтовой или никелевой смолы, следуя инструкциям производителя. Сохраните проточные, промытые и элюированные образцы для анализа. Немедленно замените буферный раствор раствора РНК-полимеразы на буферный раствор для хранения с помощью буферной обменной колонки, следуя инструкциям производителя.
Затем сконцентрируйте РНК-полимеразу до концентрации от 0,2 до 0,4 миллиграмма на миллилитр, используя центробежные фильтрующие блоки с отсечкой 10 килодальтон. Определите концентрацию с помощью спектрофотометра и подготовьте замораживающие запасы. Аликвотируйте от 20 до 50 микролитров объемов РНК-полимеразы, замораживайте запасы в пробирках для ПЦР и храните РНК-полимеразу при температуре минус 80 градусов Цельсия.
Подготовьте рабочие поверхности, включая радиационный стенд, чтобы уменьшить радиационное загрязнение. Разморозьте свежие запасы РНК-полимеразы и RpoD на льду и тщательно перемешайте все размороженные замороженные запасы перед пипеткой. Приготовьте основную реакционную смесь в отдельной смеси NTP для нуклеотидов, меченных радиоактивным изобилием, в соответствии с экспериментальными требованиями. Распределите контрольные реакции в экспериментальных наборах в ПЦР-пробирки.
После дозирования воды, реакционной смеси, РНК-полимеразы и RpoD в специальные пробирки для ПЦР смешайте реагенты пипеткой. Перенесите подготовленные материалы на радиационный стенд, добавьте АТФ, меченный альфа-32P, в NTP и перемешайте путем осторожного пипетирования. Добавьте NTP в пробирки, содержащие смеси реакций транскрипции in vitro, и начните реакцию транскрипции in vitro, добавив матрицу ДНК.
Перемешайте реакционный объем путем осторожного пипетирования и инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут в термоциклере или тепловом блоке. Удалите реакции из термоциклера или теплового блока и остановите реакции транскрипции in vitro, добавив в реакционную смесь равный объем 2X-нагрузочного красителя РНК, содержащего 50% формамида. Денатурация ферментов путем инкубации реакций при 65 градусах Цельсия в течение пяти минут в термоциклере или тепловом блоке.
Используя гель-электрофорез, разделите транскрибированную РНК in vitro в полиакриламидных гелях мочевины TBE от 10% до 15% при напряжении 180 вольт в течение 30-45 минут. После удаления любой части геля, содержащей неинкорпорированную радиоактивно меченную АТФ, подвергните гель воздействию фосфоэкрана на ночь и сфотографируйте меченную радиоактивным изолином РНК с помощью фосфоскринингового сканера. SDS-PAGE показал три полосы, соответствующие трем пептидам, RpoC, RpoB и RpoA комплекса РНК-полимеразы.
Также наблюдался пептид из 115 килодальтон, соответствующий размеру меченого MBP рекомбинантного Borreliella burgdorferi RpoD. Расщепление белковой смеси с протеазой фактора ХА привело к образованию двух важных продуктов: RpoD и MBP. Промоутерский сайт Borreliella burgdorferi FLGB был создан методом ПЦР.
Двукратное разведение концентрации RpoD приводит к снижению уровня накопленного продукта РНК. Низкая концентрация РНК-полимеразы дает меньше продуктов РНК в диапазоне концентраций RpoD. Сигнал денситометрии показал линейную зависимость между количеством RpoD, присутствующим в реакции в обоих экспериментах.
Ферментативная активность РНК-полимеразы чувствительна к множеству факторов во время очистки, хранения и экспериментального процесса. Свежие ферменты и реагенты, наряду с хорошим планированием, дают наилучшие шансы на успех в этом протоколе.
