Описанный протокол позволяет проводить фенотипический анализ гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга, а также стромальных клеток костного мозга. Его можно использовать для изучения возмущений в этих популяциях в различных условиях. По сравнению с другими ранее описанными методами, этот метод позволяет проводить фенотипический анализ гемопоэтических клеток, в частности, в двух функциональных областях костного мозга, эндостальных и центральном костном мозге, а также стромальных клетках костного мозга.
Для начала поместите усыпленное животное животом вверх на чашку Петри и сбрызните 70% этанолом. Сделайте разрез над животом с помощью ножниц и стяните кожу до лодыжек. Возьмитесь за одну из ног и отрежьте ее внизу, чтобы отделить ее от животного с помощью ножниц.
Затем снимите стопу с ноги, разрезав лодыжку, и поместите ногу в ледяной PBS 2% FBS. Затем возьмитесь за тазобедренную кость с помощью пинцета и отрежьте за ней, чтобы отделить ее от животного с помощью ножниц. Поместите тазобедренную кость в ледяной PBS 2% FBS.
Поместив ногу и тазобедренную кость в чашку Петри, очистите кости стерильным скальпелем. Затем разделите большеберцовую и бедренную кости, разрезав колено скальпелем, и поместите чистые кости в ледяной PBS 2% FBS. Поместите бедренную или большеберцовую кость в ступку с ледяным PBS 2% FBS и раздавите кость, осторожно прижав ее к стенке ступки с помощью пестика.
Затем пипеткой полученную клеточную суспензию вверх и вниз с помощью 10-миллилитровой пипетки для гомогенизации и переноса ее в 50-миллилитровую пробирку через 40-микрометровый клеточный фильтр, помещенный поверх пробирки. Промойте раствор еще небольшим количеством PBS 2% FBS и перелейте раствор в ту же 50-миллилитровую пробирку через тот же 40-микрометровый сетчатый фильтр. Центрифугируйте 50-миллилитровую пробирку при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах буфера лизиса эритроцитов при комнатной температуре, пипеткой вверх и вниз несколько раз. После двухминутной инкубации при комнатной температуре добавьте 15 миллилитров PBS 2% FBS и центрифугируйте 50-миллилитровую пробирку. Если клеточная гранула не выглядит красноватой, выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах PBS 2% FBS и перенесите клеточную суспензию в лунку 96-луночной V-образной нижней пластины для окрашивания.
После дробления кости, как показано ранее, отрежьте кончик пипетки P1000 с помощью ножниц и используйте его для переноса всего содержимого раствора в пробирку объемом 50 миллилитров. Затем центрифугируйте 50-миллилитровую пробирку при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После отказа от надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу в трех миллилитрах коллагеназы IV и этого раствора диспазы-II.
Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут. Долейте тюбик до 25 миллилитров PBS 2% FBS и вихря, чтобы перемешать. Затем перенесите содержимое в новую 50-миллилитровую пробирку через 100-микрометровый сетчатый фильтр.
Затем добавьте 15 миллилитров PBS 2% FBS в старую 50-миллилитровую пробирку и перенесите раствор в новую 50-миллилитровую пробирку через 100-микрометровый сетчатый фильтр. После центрифугирования и отбрасывания надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу клетки в пяти миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов, пипеткой вверх и вниз несколько раз пипеткой. После двухминутной инкубации при комнатной температуре добавьте 15 миллилитров PBS 2% FBS.
Опять же, центрифугируйте пробирку и, если гранула ячейки не выглядит красноватой после выброса надосадочной жидкости, ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах PBS 2% FBS и перенесите клеточную суспензию в лунку 96-луночной V-образной нижней пластины для окрашивания. Затем центрифугируйте пластину при 500 G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Поместите бедренную кость на чашку Петри и отрежьте концы кости с помощью стерильного скальпеля.
Затем промойте центральную часть кости, пропустив 100 микролитров PBS 2% FBS через внутреннюю часть кости по одному разу с каждой стороны, используя инсулиновый шприц без мертвого объема 0,5 миллилитра, и собрав раствор в микроцентрифужную пробирку, содержащую один миллилитр PBS 2% FBS. Затем переносят клеточную суспензию в 50-миллилитровую пробирку, помеченную как промытый костный мозг, содержащую четыре миллилитра PBS 2% FBS. Раздавите концы кости в ступке с ледяным PBS 2%FBS, аккуратно прижав их к стенке ступки с помощью пестика.
После того, как клеточная суспензия гомогенизирована, перенесите ее в 50-миллилитровую пробирку, помеченную как измельченный костный мозг, через 40-микрометровое клеточное ситечко. Наконец, промойте раствор еще небольшим количеством PBS 2% FBS и перелейте раствор в ту же пробирку. Анализ проточной цитометрии гемопоэтических стволовых клеток и мультипотентных предшественников проводили в общем костном мозге здоровой молодой взрослой мыши C57BL6J.
При анализе стромальных клеток, эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток в общем костном мозге мезенхимальные стволовые клетки могут быть легко идентифицированы на основе экспрессии рецептора лептина, а эндотелиальные клетки могут быть идентифицированы на основе экспрессии CD31 и SCA-1. Проточный цитометрический анализ эндотелиальных клеток в общем костном мозге, показывающий различение артериолярных и синусоидальных эндотелиальных клеток на основе ICAM1. Количественная оценка артериальных и синусоидальных эндотелиальных клеток костного мозга в центральной и эндостальной ткани костного мозга показывает, что эндотелиальные клетки артериального костного мозга более распространены в эндостальных областях, в то время как синусоиды чаще встречаются в центральных областях костного мозга.
При получении промытого костного мозга не следует превышать объем или количество раз, указанное для прохождения PBS 2% FBS через внутреннюю часть центральной части кости. Сочетание описанного метода с функциональными анализами фенотипически анализируемых клеточных популяций позволит получить дополнительную ценную информацию о потенциальных возмущениях этих популяций, происходящих в исследуемых условиях. Описанный протокол позволяет проводить фенотипический анализ гемопоэтических клеток дифференциально в эндостальном и центральном костном мозге, что позволяет исследователям исследовать нарушения гематопиоза, потенциально происходящие именно в этих местах костного мозга.
