Метаболические изменения в гематопоэтических стволовых клетках и клетках-прародителях позволяют им перейти от их тихие состояния к состоянию дифференциации для поддержания требований к образованию крови. Изменение метаболической пластичности гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников приводит к гематологическим расстройствам. Наш протокол поможет измерить метаболическую регуляции и здоровье гематопоэтических стволовых и прародителя клеток во время развития крови и заболеваний.
Анализ митохондриального дыхания и гликолиза гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников затруднен, так как они являются хрупкой и редкой популяцией. Наш оптимизированный протокол позволяет изоляции большего количества гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников из муринового костного мозга, улучшает их жизнеспособность во время инкубации, облегчает внеклеточный анализ потока непритязательных ГСП, а также обеспечивает оптимизированные параметры инъекций для препарата, ориентированного на окислительное фосфорилирование, а также гликолитические пути. Для начала этой процедуры заполните колодцы коммунальной плиты и камеры вокруг колодцев стерильной водой.
Погрузите сенсорный картридж в утилиту пластины убедившись, что датчики полностью покрыты водой. Затем поместите картридж, погруженный в утилиту пластины в не CO2 инкубатор при 37 градусов по Цельсию, чтобы инкубировать на ночь. В шкафе биобезопасности класса II добавьте 40 микролитров коммерчески доступного решения 0,1%PLL к каждой пластине анализа.
Обложка анализ пластины с крышкой, представленной в комплекте и инкубировать закрытую пластину при комнатной температуре под капотом в течение одного часа. После этого используйте стерильный вакуумный аспиратор, чтобы удалить избыток раствора и высушить пластину под капотом. Для сбора мононуклеированных клеток костного мозга мурина добавьте пять миллилитров градиентной среды плотности в 15 миллилитров конической трубки.
Медленно добавьте пять миллилитров подвески клеток костного мозга, убедившись, что клетки остаются в качестве слоя выше градиентной среды плотности. Центрифуга при 500 г и при комнатной температуре в течение 30 минут убедившись, что центрифуга находится на самом низком возможном ускорении. Урожай среднего интерфейса мононуклеированных клеток в свежую 15 миллилитровую трубку.
Затем мыть клетки с пятью миллилитров 1X PBS, содержащих 2%FBS. Центрифуга при 500 градусах г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно посовелите клетки в 300 микролитров 1X PBS, содержащих 2%FBS.
Далее, aliquot 10 микролитров подвески ячейки для неокрашенных или одноцветного управления в трубке FACS. Для сбора LSK HSPCs из мононуклеированных клеток костного мозга мурина добавьте 15 микролитров биотинового коктейля антител к 300 микролитров мононуклеированных клеток костного мозга. Для сбора LSK HSPCs из мононуклеированных клеток костного мозга мурина добавьте 15 микролитров биотинового коктейля антител к 300 микролитров мононуклеированных клеток костного мозга.
Поместите трубки в ведро со льдом, расположенные на шейкере в холодильнике, чтобы инкубировать при четырех градусах Цельсия с волнением в течение 30 минут. Затем добавьте 10 миллилитров предварительно охлажденного 1X PBS, содержащего 2%FBS в клетки. Центрифуга при 500 градусах г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте клеточные гранулы в 400 микролитров 1X PBS, содержащих 2%FBS. Кратко вихрь анти-биотин микробусы перед использованием. Добавьте 80 микролитров микробусов к каждому образцу и хорошо перемешайте.
Инкубировать в течение еще 20 минут при четырех градусах по Цельсию с возбуждением. После этого добавьте в клетки 10 миллилитров предварительно охлажденного PBS, содержащего 2%FBS. Центрифуга трубки в 500 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Отбросьте супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в один миллилитр PBS, содержащий 2%FBS. Храните подвеску клетки при четырех градусах Цельсия при настройке магнитного блока разделения. Поместите столбец в магнитное поле для магнитной помощи сепаратора сортировки клеток при четырех градусах цельсия.
Подготовь колонку к магнитному разделению, опоясыв ее тремя миллилитровами 1X PBS, содержащими 2%FBS под гравитационным потоком при четырех градусах Цельсия. Добавьте подвеску клетки к предварительно влажной колонке при четырех градусах по Цельсию. Разрешить всем клеткам пройти через колонку при четырех градусах по Цельсию и собирать сточные воды в 15 миллилитров конической трубки.
Далее, мыть колонку с тремя миллилитров 1X PBS и 2%FBS при четырех градусах по Цельсию. Повторите эту стирку три раза. Соберите поток через и держать его на четыре градуса по Цельсию.
Центрифуга конической трубки, содержащей поток через 500 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и переполнив клетки в 0,5 миллилитров 1X PBS с 2%FBS и перенесите подвеску в трубку FACS. Затем добавьте 24 микролитров коктейля LSK антител к каждому 10 миллионам клеток.
Обложка трубки с фольгой и инкубировать в темноте при четырех градусах по Цельсию с волнением в течение одного часа. После этого добавьте три миллилитров 1X PBS с 2%FBS в трубку FACS. Центрифуга при 500 градусах г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Отбросьте супернатант и будем повторно помещенными антителами клетками в одном миллилитре 1X PBS, содержащем 2%FBS. Перед сортировкой добавьте один микролитр по миллиграмму на миллилитр йодида пропидия в клеточную подвеску и используйте 40-микрометровый ситечко для фильтрации содержимого трубки FACS. Во-первых, центрифуга собранных клеток LSK в 500 раз г и при комнатной температуре в течение пяти минут.
Отбросьте супернатант и повторно наполнив клетки полными средствами массовой информации до конечной концентрации не менее 70 000 клеток на 40 микролитров. Семя 40 микролитров этой ячейки подвески в колодцы PLL покрытием восемь хорошо пластины убедившись, чтобы оставить все угловые колодцы пустыми. Центрифуга пластины в 450 раз г и при комнатной температуре в течение одной минуты.
Используйте перевернутый микроскоп, чтобы обеспечить клетки прикреплены к нижней части колодцев. После этого добавьте 135 микролитров полного мультимедиа к клеткам в каждой хорошо доведя окончательный объем каждой колодец до 175 микролитров. Добавьте 175 микролитров полного мультимедиа в два угла пластины в качестве заготовок.
Инкубировать клетки в инкубаторе без CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. Затем найте программу для анализатора, чтобы добавить наркотики в каждый колодец пластины, как указано в таблице два и таблице три текстового протокола. Для митохондриального стресс-теста, получить картридж датчика в утилите пластины из инкубатора так, что каждая хорошо имеет окончательную концентрацию двух микромоляных олигомицина, 1,5 микромолара FCCP, и 0,5 микромолара либо ротенон и антимицин А по мере необходимости.
Снимите крышку с сенсорного картриджа и поместите ее на поднос с инструментами. Начните процесс калибровки, который займет 20 минут. Когда калибровка завершена, удалите утилиту пластины и заменить его с анализом пластины, содержащей клетки LSK.
Пресса продолжает начинать ранее установленную программу. Когда программа будет завершена, получить данные и проанализировать его. В этом исследовании, максимальное количество жизнеспособных murine LSK HSPCs изолированы и их гликолиз и митохондриальный метаболизм измеряется с внеклеточного анализатора потока.
Хотя внеклеточный анализ потока традиционно используется для адептов клеток, этот метод делает LSK HSPCs приверженцем PLL покрытием скважин, что позволяет для измерения внеклеточного потока и, следовательно, метаболического здоровья LSK HSPCs. Для измерения митохондриального дыхания через скорость потребления кислорода и гликолиза через внеклеточную скорость подкисления в базальных и стрессовых условиях, препараты, которые мешают гликолизу и митохондриальному дыханию вводятся последовательно. Как и ожидалось, базальный уровень внеклеточного подкисления выше для LSK HSPCs, культурированных в глюкозе и пирувате положительных медиа по сравнению с теми, которые культурированы в негативных средствах массовой информации.
Инъекция с глюкозой не меняла экстраклеточной скорости подкисления клеток, культурных в положительных средствах массовой информации, но она увеличила гликолиз клеток в отрицательных средствах массовой информации. Тем не менее, базальный уровень этих клеток по-прежнему остается ниже в положительной группе. Инъекция олигомицином активировала гликолиз на максимальном уровне в положительной группе, но не повлияла на отрицательную группу.
Инъекция с аналогом глюкозы при 2-DG вернула уровень внеклеточного подкисления до негликолитических уровней. Для митохондриального стресс-теста инъекция олигомицина гиперполяризировала митохондриальную мембрану, предотвращая больше протонной перекачки через комплексы ETC и тем самым снижая скорость митохондриального дыхания. Инъекция FCCP толкает скорость потребления кислорода до максимума, как клетки пытаются восстановить митохондриальный мембранный потенциал.
Инъекция с двумя другими ингибиторами транспортной цепи электронов приводит к полной остановке митохондриального дыхания, и таким образом уровень потребления кислорода вернулся к минимальному уровню. Пожалуйста, избегайте использования буфера лиза красных клеток для изоляции моноядерных клеток. Мы рекомендуем разделение градиента Ficoll, чтобы предотвратить образование сгустка и уменьшить потерю LSK.
Используя наш оптимизированный метод, мы можем измерить митохондриальное дыхание и гликолиз редких и хрупких гематопоэтических стволовых и прародителя клеток и изучение метаболических сигналов регулировать нормальный и злокачественный гематопоэз.
