Рассечение руки кишечника этого элегана является мощным, но простым методом, который позволяет исследовать различные аспекты постбиологии путем выделения ткани в клеточных популяциях. Этот мелкомасштабный метод рассечения тканей прост в выполнении и использует стандартное лабораторное оборудование, что делает его надежным и доступным методом для многих. Начните с вытягивания стандартного стеклянного капилляра длиной 4 дюйма и наружным диаметром 1,2 миллиметра в форму инъекционной иглы с помощью съемника иглы.
Приготовьте не менее 5 50 и 100 микрокапиллярных пипеток. Используйте микрокузницу, чтобы подделать микрокапиллярные пипетки до 50 микрометров или 100 микрометров, отметив 3 или 5 меток соответственно, как указано на глазной линейке микрокузницы под объективом 5X. Затем прикрепите микрокапиллярную пипетку ко рту аспираторной трубке.
Приготовьте одну ванну M9 и одну буферную ванну для рассечения, добавив 2 миллилитра M9 в стерильную чашку Петри диаметром 35 миллиметров и 2 миллилитра буфера для рассечения в другую стерильную чашку Петри диаметром 35 миллиметров. Наконец, добавьте 100 микролитров рабочего сывороточного альбумина крупного рогатого скота или раствора BSA в каждую ванну и перемешайте его путем закручивания. Для приготовления рассеченного массива добавляют 150 микролитров рабочего раствора левамизола в первую лунку двух скважин скольжения вогнутости и 150 микролитров рассеченного буфера во вторую лунку.
Добавьте в каждую лунку 20 микролитров рабочего раствора BSA. Чтобы вручную рассечь кишечник червя caenorhabditis elegans CL2122, переместите 20 взрослых червей из среды роста нематоды или пластины NGM в ванну M9 с помощью червячного кирка. Затем переместите всех 20 червей из ванны M9 в буферную ванну для рассечения.
Далее перемещают партии по 10 червей из рассечения буферной ванны в скважину, содержащую раствор левамизола. Как только движение червей замедлится, быстро переместите их из колодца левамизола в колодец, содержащий буфер рассечения. Позвольте червям начать немного двигаться в буфере рассечения задолго до начала рассечения.
Под флуоресцентным рассекающим прицелом сделайте один разрез сразу за глоткой или перед прямой кишкой, используя подкожную иглу, чтобы произвести равное количество передних средних половин и средних задних половинок кишечника. Ожидая около одной минуты, пока кишечник максимально выдавится из организма, добавьте 50 микролитров хелатного буфера в скважину, чтобы помочь уменьшить деградацию РНК. Для облегчения экструзии кишечника используйте 100-микрокапиллярную пипетку, прикрепленную к аспиратору рта, и втягивайте червя внутрь и из пипетки.
Как только кишечник будет достаточно экструдирован, используйте иглу для подкожных инъекций 27 калибра, чтобы отрезать ее от остальной части тела и любой оставшейся гонады. Аспирировать участок кишечника с помощью микрокапиллярной пипетки и перенести его в микроцентрифужную трубку, содержащую реагент выделения нуклеиновых кислот. Держите изолированный кишечник на льду и повторите процедуру для оставшихся кишок.
Этот метод продемонстрировал успешное рассечение и выделение кишечника. Метод также сообщал о выделении РНК и микробном наблюдении из изолированных кишечников. Поскольку черви CL2122 укрывали специфический металл кишечника два промотора, слитые с GFP, кишечник наблюдался как зеленое свечение под флуоресцентной рассекающей областью.
Рассечение взрослого червя показало экструдированный кишечник после того, как он сделал первичный разрез сразу за глоткой. Успешное рассечение кишечного сегмента оказалось свободным от видимых загрязнений, таких как обломки гонады или туши. Напротив, неудачное рассечение показало гонаду и тушу, прикрепленные к кишечному сегменту.
Выход РНК от рассечения руки был более эффективным, поскольку окончательный образец из 60 общих участков кишечника дал примерно 15 нанограммов высококачественной общей РНК. Дезагрегация червей и выделение FACS клеток кишечника были менее эффективными, поскольку для получения соразмерных количеств общей РНК требовались сотни тысяч кишечных клеток. Общая амплификация микробной геномной ДНК с использованием панбактериального анализа обнаружения показала, что окончательный образец из 40 общих участков кишечника из передней, средней и средней задних областей дал низкое, но обнаруживаемое количество около 0,009 пикограмм общей микробной ДНК.
Самое главное, что нужно помнить при выполнении этой процедуры, это не парализовать червей перед рассечением, так как это может ингибировать максимальную экструзию кишечника.
