Трансдукция незрелых тимоцитов ретровирусными векторами и культивирование этих клеток на стромальных клетках OP9 DL4 является сложной задачей. Этот подробный протокол сэкономит время и усилия исследователей при оптимизации этих систем. Этот метод обеспечивает гибкую систему in vitro для изучения влияния генетических модификаций на незрелые Т-клетки и может быть полезен для изучения развития Т-клеток и рака.
Продемонстрирует процедуру Жизель Родригес, постдокторант из моей лаборатории. Для начала засейте клетки-продуценты ретровируса за 18-24 часа до трансфекции при слиянии от 70 до 90% в каждой лунке шестилуночной пластины для культивирования тканей, содержащей два миллилитра клетки-продуцента ретровируса или среды RPC. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
Чтобы трансфицировать клетки, замените среду свежей средой RPC за час до трансфекции. Приготовьте смеси для липофекции, разбавив четыре микрограмма ДНК, содержащие два микрограмма вспомогательной плазмиды pCL-Eco и два микрограмма трансферной плазмиды pMIG, в 250 микролитрах восстановленной сывороточной среды и аккуратно перемешайте. Далее смешайте 10 микролитров реагента для трансфекции и 250 микролитров восстановленной сывороточной среды и выдержите пять минут при комнатной температуре.
После пяти минут инкубации соедините разбавленную ДНК с разбавленным реагентом для трансфекции. Аккуратно перемешайте и выдерживайте 20-25 минут при комнатной температуре. Аккуратно добавьте 500 микролитров смеси ДНК и реагента для трансфекции в лунку, содержащую клетки-продуценты ретровируса, опустив их на клетки круговыми движениями.
Аккуратно перемешайте, раскачивая тарелку вперед и назад, а затем инкубируйте тарелку в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16–24 часов. Примерно через 16 часов после трансфекции замените старую среду двумя миллилитрами свежей среды RPC и продолжайте инкубацию клеток при 37 градусах Цельсия в течение 20-24 часов. Чтобы приготовить одноклеточную суспензию тимоцитов, поместите собранный тимус от усыпленных мышей в пять миллилитров PBS в чашку Петри.
Используя стерильные стеклянные предметные стекла, поместите тимус между матовыми поверхностями предметных стекол и аккуратно потрите предметные стекла друг о друга, перекатывая тимус между двумя предметными стеклами. Промойте предметные стекла, чтобы собрать клетки и выбросить оставшуюся стромальную ткань тимуса. Отфильтруйте пять миллилитров суспензии тимуса через 30- или 40-микрометровый фильтр клеточного фильтра и центрифугируйте клетки при 300 G в течение 10 минут.
После удаления надосадочной жидкости лизируют эритроциты, добавляя один миллилитр буфера для лизиса ACK на пробирку в течение одной минуты. Добавьте пять миллилитров буфера для истощения клеток, чтобы деактивировать буфер лизиса ACK, центрифугируйте суспензию при 300 г в течение 10 минут и ресуспендируйте в одном-пяти миллилитрах буфера истощения клеток для подсчета. После подсчета клеток и центрифугирования при 300 G в течение 10 минут ресуспендируют клетки за один раз от 10 до седьмого в 80 микролитрах буфера истощения клеток.
Добавьте по 10 микролитров микрогранул CD4 и CD8 по 10 к седьмым клеткам. Хорошо перемешать и выдержать 15 минут в темноте в холодильнике. Затем подготовьте обеднительную колонну, промыв ее двумя миллилитрами обедненного буфера и выбросив проточный.
Промойте инкубированные клетки, добавив один-два миллилитра обедненного буфера на 10 семь клеток. Центрифугу при 300 г в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Затем нанесите ресуспендированную клеточную суспензию на колонку и соберите поток немеченых клеток.
Дважды промойте колонну одним миллилитром буфера и соберите проточный. Окрашивайте контроль эффективности истощения, разделив 200 микролитров клеток, собранных до истощения, на четыре пробирки FACS: неокрашенные, одноокрашенные CD4, одноокрашенные CD8 и дважды окрашенные CD4 и CD8. Используйте неокрашенные и одноокрашенные образцы для настройки параметров проточной цитометрии.
Используйте 1000 микролитров клеток, собранных после истощения, для окрашивания на CD4 и CD8 и сравните с двойным окрашенным образцом, собранным до истощения. Чтобы культивировать тимоциты, поместите от двух до пяти раз от 10 до пятого до одного раза от 10 до шестого после истощения тимоцитов в колбу T25 с 80-90% сливающимися клетками OP9 DL4 в среде OP9, содержащей цитокины. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов на клетках OP9 DL4.
Чтобы собрать ретровирус, соберите надосадочную жидкость, содержащую ретровирусы, из пересеченных клеток, наклонив шестилуночную пластину, а затем расположив шприц объемом от трех до пяти миллилитров на дне пластины, потянув за поршень для аспирации надосадочной жидкости. Отфильтруйте надосадочную жидкость ретровируса через шприцевой фильтр размером 0,45 микрометра и соберите фильтрат в 50-миллилитровую пробирку. Замените среду двумя миллилитрами свежей среды RPC и продолжайте инкубацию клеток при 37 градусах Цельсия в течение 20-24 часов для второй трансдукции.
собрать тимоциты из культуры OP9 DL4 путем агрессивного пипетирования для удаления тимоцитов и клеток OP9 DL4 с поверхности колбы. Отфильтруйте клеточную суспензию через 40-микрометровый сетчатый фильтр, чтобы удалить большинство ячеек OP9 DL4 и собрать фильтрат в 50-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте тимоциты и фильтрат при 300 г в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируют тимоциты в среде от 0,5 до одного миллилитра OP9 с цитокинами. Добавьте один-два миллилитра среды RPC, содержащей вирус. Затем добавьте гексаметрин бромид в количестве восемь микрограммов на миллилитр общей клеточной суспензии.
Спинокулируйте содержимое, центрифугируя клетки при 850 G в течение одного часа при комнатной температуре. Ресуспендируют клетки в шести миллилитрах среды OP9 с цитокинами на колбу и добавляют суспензию обратно в монослой клеток OP9 DL4. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.
Повторите этапы сбора ретровируса, используя новую лунку надосадочной жидкости, содержащей ретровирус. Сохраняйте трансдуцированные тимоциты на культуре OP9 DL4 в течение двух-пяти дней или замораживайте по мере необходимости. Эффективность истощения оценивали проточно-цитометрически путем мечения магнитно-немеченой клеточной фракции для CD4 и CD8 после иммуномагнитного разделения клеток и анализа этого на двумерном бивариантном точечном графике.
Хороший выход двойных отрицательных клеток для CD4 и CD8 составляет 95% или выше, как показано здесь. При использовании векторов, экспрессирующих скрининговые маркеры, такие как ген флуоресценции, транссекция и трансдукция могут быть грубо и эмпирически оценены с помощью флуоресцентной микроскопии. Эффективность трансдукции анализировали путем забора тимоцитов из монослоя OP9 DL4.
и изучение экспрессии гена флуоресценции с помощью проточной цитометрии. Эффективность трансдукции с использованием пустого ретровирусного вектора с GFP в качестве репортерного гена составила 84,2%, дифференцировка Т-клеток на клетках OP9 DL4 наблюдалась через четыре дня после трансдукции. Проточный цитометрический анализ дифференцировки клеток, индуцированной кокультурой на клетках OP9 DL4 и экспрессией трансгенов, где клетки были мечены для CD4, CD8, CD44 и CD25.
Трансдукция двойных отрицательных тимоцитов с пустым ретровирусным вектором pMIG представляла примерно те же пропорции одиночных положительных, двойных положительных, двойных отрицательных и ее подстадий двойного отрицательного от одного до четырех, что и нетрансдуцированные тимоциты, что указывает на то, что на развитие Т-клеток процесс трансдукции не влиял. Самая сложная задача при попытке реплицировать этот протокол заключается в том, чтобы убедиться, что различные типы ячеек управляются одновременно скоординированным образом. Чрезмерная экспрессия онкогенов в незрелых тимоцитах иногда может влиять на нормальное развитие Т-клеток, поэтому последующее иммунофенотипирование с помощью проточной цитометрии является полезным способом узнать, в каком направлении двигаться.
Онкогенный потенциал трансдуцированных Т-клеток, дифференцированных на клетках эмбрионального слоя, может быть дополнительно исследован путем инъекции мышам с ослабленным иммунитетом.
