Протокол обеспечивает точную, безопасную и эффективную нехирургическую альтернативу традиционным хирургическим и слепым методам инъекций. Это также наиболее точный метод инъекций для атрофии тимусов у пожилых или иммунодефицитных мышей. Ключевым преимуществом является минимально напряженная процедура инъекции, которая является очень безопасной и точной, но также и быстрой, что позволяет проводить крупномасштабные эксперименты без ущерба для данных от хирургической иммуносупрессии, связанной со стрессом.
Поддержание выравнивания иглы и преобразователя при продвижении ее через грудную стенку требует некоторой практики. Поэтому мы рекомендуем сотрудничать с опытным интервенционным радиологом для выполнения инъекций или обучения. Помочь в демонстрации процедуры будет Шайна Анунсио, техник из моей лаборатории.
Для начала нанесите тонкий слой крема для депиляции на переднюю область грудной клетки мышей менее чем на одну минуту, чтобы удалить мех. Используйте мокрое бумажное полотенце, чтобы удалить крем и рассыпчатый мех. Подтвердите соответствующую анестезирующую глубину, не реагируя на защемление задней лапы.
Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Поместите по одной мышке за раз в положение лежа на спине на нагретой платформе станции ультразвуковой визуализации мелких животных с носовым конусом на месте. Закрепите мышь на сцене с помощью медицинской клейкой ленты на задних и передних конечностях.
Продезинфицируйте кожу верхней части грудной клетки без меха с помощью аппликатора хлоргексидина глюконата. Активируйте самый высокочастотный линейный зонд. Как правило, зонд с самым высоким пространственным разрешением для размеров изображаемого животного.
Активируйте зонд, нажав соответствующую кнопку после экрана запуска. Чтобы оптимизировать настройки ультразвука для визуализации и инъекции, отрегулируйте глубину поля зрения до соответствующего размера для целевого животного, регулируя вертикально ориентированные ползунки в правой части экрана. Отрегулируйте усиление шкалы серого, переместив кнопку вдоль горизонтальной полосы в нижней части экрана.
Затем отрегулируйте фокусную зону до ожидаемого уровня тимуса. Нанесите около одного миллилитра ультразвукового геля на поверхность преобразователя, пока он находится в вертикальном положении, либо в держателе ультразвукового аппарата, либо в руках помощника. Чтобы подготовить небольшое стерильное поле рядом с нагретой платформой, опорожните стерильную крышку зонда, резинку, стерильные перчатки и стерильный ультразвуковой гель на стерильное поле.
Затем наденьте стерильные перчатки. Аккуратно поместите стерильную крышку зонда на ультразвуковой преобразователь и гель. Для поддержания стерильности прикасайтесь только к стерильной крышке.
Проведите стерильной резинкой по крышке зонда, чтобы удержать ее на месте. Поместите два-три миллилитра стерильного ультразвукового геля на датчик. Поместите ультразвуковой гелеобразный зонд вертикально на продезинфицированную часть передней грудной стенки мыши для первоначальной визуализации, сохраняя при этом стерильность.
Просматривайте и оптимизируйте ультразвуковое изображение, как показано ранее. Чтобы отсканировать переднюю грудную клетку мыши в поперечной плоскости, удерживайте датчик вертикально и перемещайте его вверх и вниз от шеи к животу кистью или размашистым движением. С сердцем, сосредоточенным в поле зрения, проведите датчик немного к шее.
Обратите внимание на две круглые парные черные структуры по обе стороны верхней части груди. Используя ультразвуковой зонд, найдите самую широкую часть тимуса, которая обычно является идеальным целевым местом для инъекции. Предугадывайте горизонтальную траекторию иглы в выбранном месте и отмечайте, где в этом месте расположены основные кровеносные сосуды.
Этих сосудов следует избегать во время инъекции. Кровеносные сосуды будут представлять собой гипоэхогенные пульсирующие структуры. Если вы не уверены, активируйте цветной доплеровский режим, нажав цветовую кнопку на экране, чтобы проверить поток внутри сосудов.
Держите датчик в одной руке и иглу инсулина 30-го калибра с 10 микролитрами инъекционного введения в другой. Чтобы начать процесс инъекции, переместите преобразователь в боковом направлении так, чтобы тимус находился вне центра в ультразвуковом поле зрения. Убедитесь, что другая сторона поля зрения состоит в основном из ультразвукового геля и ничего больше.
Поместите кончик иглы в гель под датчик и медленно перемещайте иглу, пока она не визуализируется рядом с поверхностью кожи. При непрерывной визуализации иглы под ультразвуком вставьте иглу в вилочковую железу с чрескожной траекторией вдали от кровеносных сосудов. Используйте поперечную горизонтальную траекторию тимуса, чтобы поместить кончик иглы в вилочковую долю, противоположную месту входа.
Как только кончик иглы окажется внутри нужной части тимуса, быстро введите содержимое из шприца 30-го калибра, используя сонографическую визуализацию. Чтобы стабилизировать шприц во время введения и инъекции иглы, держите шприц между большим и третьим пальцами и управляйте плунжером шприца указательным пальцем. Извлеките иглу после того, как все содержимое будет отложено.
У молодых мышей идентификация вилочковой железы была простой из-за большого размера железы. Это было сложнее у пожилых или иммунодефицитных мышей. Тем не менее, это все еще было очень осуществимо с современным ультразвуковым оборудованием.
Успешная инъекция была отмечена, когда игла не пересекала критические структуры, такие как сердце, аорта или одна из нижних вен. Наконечник иглы визуализировали в его целевом месте во время инъекции, подтверждая внутриутимическое отложение. Внутриутимическое расположение инъекции было подтверждено с использованием Люциферина в качестве инъекции в трансгенных мышей люциферазы.
Они были немедленно оценены с помощью биолюминесцентной визуализации, подтверждающей правильное местоположение инъекции без ущерба для животного. Альтернативно, Trypan Blue вводили в качестве визуального маркера места инъекции и точности инъекции с использованием ex vivo с некропсией. Наша группа использовала этот метод для нескольких крупных исследований, включая исследования иммунотерапии рака, основанные на инъекции генетически модифицированных клеток-предшественников, и для улучшения функции тимуса у иммунодефицитных мышей.
