このプロトコルは、従来の外科的および盲検注射方法に代わる、正確で安全かつ効率的な非外科的代替手段を提供します。また、高齢または免疫不全マウスの萎縮胸腺に対する最も正確な注射技術でもあります。主な利点は、非常に安全で正確でありながら迅速で、ストレスの少ない注射手順であるため、外科的ストレス関連の免疫抑制によるデータを損なうことなく大規模な実験を可能にすることです。
針とトランスデューサーの位置合わせを維持しながら胸壁を通して進めるには、ある程度の練習が必要です。したがって、経験豊富なインターベンショナル放射線科医と協力して注射を行ったり、トレーニングを提供したりすることをお勧めします。手順のデモンストレーションを手伝うのは、私の研究室の技術者であるシャイナ・アヌンシオです。
まず、脱毛クリームの薄層をマウスの前胸部に1分未満塗布して毛皮を取り除きます。濡れたペーパータオルを使用して、クリームとゆるい毛皮を取り除きます。後足のつまみに対する無反応により、適切な麻酔薬の深さを確認します。
眼科用軟膏を両目に塗り、角膜の乾燥を防ぎます。ノーズコーンを所定の位置に置いた状態で、小動物超音波イメージングステーションの加熱されたプラットフォームの仰臥位に一度に1匹のマウスを置きます。後肢と前肢に医療用粘着テープでマウスをステージに固定します。
グルコン酸クロルヘキシジンアプリケーターを使用して、毛皮のない胸部の上部皮膚を消毒します。利用可能な最高周波数リニアプローブをアクティブにします。典型的には、画像化される動物のサイズに対して最も高い空間分解能を有するプローブ。
起動画面の後に対応するボタンをタップして、プローブをアクティブにします。イメージングと注射の超音波設定を最適化するには、画面の右側にある垂直方向のスライダーを調整して、視野の深さを対象動物に適したサイズに調整します。画面下部の水平バーに沿ってボタンをスライドさせて、グレースケールゲインを調整します。
次に、焦点ゾーンを胸腺の予想されるレベルに調整します。トランスデューサーの表面を直立させた状態で、超音波装置ホルダーまたはアシスタントの手に約1ミリリットルの超音波ゲルを塗布します。加熱されたプラットフォームの隣に小さな滅菌フィールドを準備するには、滅菌プローブカバー、輪ゴム、滅菌手袋、および滅菌超音波ゲルを滅菌フィールドに空にします。
次に、滅菌手袋を着用します。滅菌プローブカバーを超音波トランスデューサーとゲルの上に慎重に置きます。無菌性を維持するために、滅菌カバーにのみ触れてください。
滅菌輪ゴムをプローブカバーの上にスライドさせて、所定の位置に保ちます。2〜3ミリリットルの滅菌超音波ゲルをトランスデューサーに置きます。超音波ゲルトッププローブをマウスの前胸壁の消毒部分に垂直に配置し、無菌性を維持しながら初期イメージングを行います。
前に示したように、超音波画像を表示して最適化します。マウスの前胸部を横方向の平面でスキャンするには、トランスデューサーを垂直に持ち、絵筆のような、または掃引する動きで首から腹部まで上下に動かします。心臓を視野の中央に向け、トランスデューサーを首に向かって少しスイープします。
胸の上部の両側にある2つの丸いペアの黒い構造に注意してください。超音波プローブを使用して、通常は注射の理想的な標的部位である胸腺の最も広い部分を見つけます。選択した場所で水平針の軌道を予測し、この部位の主要な血管がどこにあるかをメモします。
これらの血管は注射中は避けるべきです。血管は低エコー性拍動構造になります。よくわからない場合は、画面上のカラーボタンをタップして血管内の流れを確認し、カラードップラーモードをアクティブにします。
片手にトランスデューサーを持ち、もう片方の手に10マイクロリットルの注射液を入れた30ゲージのインスリン針を持ちます。注入プロセスを開始するには、胸腺が超音波視野の中心から外れるようにトランスデューサーを横方向に動かします。視野の反対側が主に超音波ゲルで構成され、他には何も含まれていないことを確認してください。
針の先端をトランスデューサーの下のゲルに入れ、皮膚表面に隣接して視覚化されるまで針をゆっくりと動かします。超音波下で針を連続的にイメージングしながら、血管から離れて経皮軌道で胸腺に針を挿入します。交差胸腺水平軌道を使用して、針先を入口部位の反対側の胸腺葉に配置します。
針先が胸腺の目的の部分に入ったら、超音波検査の視覚化を使用しながら、30ゲージの注射器から内容物をすばやく注入します。針の挿入および注入中にシリンジを安定させるには、シリンジを親指と人差し指の間に保持し、人差し指でシリンジプランジャーを制御します。すべての内容物が堆積した後、針を取り外します。
若いマウスでは、胸腺のサイズが大きいため、胸腺の特定は簡単でした。それは、高齢または免疫不全マウスではより困難でした。しかし、それはまだ現代の超音波装置で非常に実行可能でした。
注射の成功は、針が心臓、大動脈、または下大静脈の1つなどの重要な構造を横断しなかった場合に認められました。注射中に針先を標的位置に視覚化し、胸腺内沈着を確認しました。注射の胸腺内位置は、ルシフェラーゼトランスジェニックマウスへの注射物としてルシフェリンを用いて確認された。
これらは生物発光イメージングで即座に評価され、動物を犠牲にすることなく注射の正しい位置を確認しました。あるいは、トリパンブルーを、剖検を伴うex vivoを用いて注射部位および注射精度の視覚マーカーとして注射した。私たちのグループでは、遺伝子改変前駆細胞の注入に基づく癌免疫療法研究を含むいくつかの大規模な研究にこの技術を使用し、免疫不全マウスの胸腺機能を改善しています。
