이 프로토콜은 기존의 수술 및 맹검 주사 방법에 대한 정확하고 안전하며 효율적인 비수술적 대안을 제공합니다. 또한 노화 또는 면역 결핍 마우스의 위축 흉선에 대한 가장 정확한 주사 기술입니다. 주요 장점은 매우 안전하고 정확하지만 신속한 최소한의 스트레스 주사 절차이므로 외과 적 스트레스 관련 면역 억제로 인한 데이터 손상없이 대규모 실험이 가능합니다.
바늘과 변환기의 정렬을 유지하면서 흉벽을 통해 전진하려면 약간의 연습이 필요합니다. 따라서 경험이 풍부한 중재적 방사선 전문의와 협력하여 주사를 수행하거나 교육을 제공하는 것이 좋습니다. 절차를 시연하는 데 도움이되는 것은 내 실험실의 기술자 인 Shaina Anuncio입니다.
시작하려면 모피를 제거하기 위해 1 분 미만 동안 마우스의 앞쪽 가슴 부위에 얇은 제모 크림을 바르십시오. 젖은 종이 타월을 사용하여 크림과 느슨한 털을 제거하십시오. 뒷발 핀치에 반응하지 않아 적절한 마취 깊이를 확인하십시오.
각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오. 코 콘이 제자리에 있는 작은 동물 초음파 이미징 스테이션의 가열된 플랫폼의 앙와위 위치에 한 번에 한 마리의 마우스를 놓습니다. 뒷다리와 앞다리에 의료용 접착 테이프로 마우스를 무대에 고정합니다.
클로르헥시딘 글루코 네이트 애플리케이터를 사용하여 털이없는 상부 흉부 피부를 소독하십시오. 사용 가능한 가장 높은 주파수 선형 프로브를 활성화합니다. 전형적으로, 프로브는 이미징되는 동물의 크기에 대해 가장 높은 공간 해상도를 갖는다.
시작 화면 후 해당 버튼을 눌러 프로브를 활성화합니다. 이미징 및 주입을 위한 초음파 설정을 최적화하려면 화면 오른쪽에 있는 수직 방향 슬라이더를 조정하여 시야 깊이를 대상 동물에 적합한 크기로 조정합니다. 화면 하단의 수평 막대를 따라 버튼을 밀어 그레이 스케일 게인을 조정합니다.
그런 다음 초점 영역을 흉선의 예상 수준으로 조정하십시오. 트랜스듀서 표면에 약 1밀리리터의 초음파 젤을 바르고 똑바로 서 있는 동안 초음파 기계 홀더에 놓거나 조수의 손에 놓습니다. 가열된 플랫폼 옆에 작은 멸균 필드를 준비하려면 멸균 프로브 커버, 고무 밴드, 멸균 장갑 및 멸균 초음파 젤을 멸균 필드에 비웁니다.
그런 다음 멸균 장갑을 착용하십시오. 멸균 프로브 덮개를 초음파 변환기와 젤 위에 조심스럽게 놓습니다. 멸균 상태를 유지하려면 멸균 덮개 만 만지십시오.
멸균 고무 밴드를 프로브 덮개 위로 밀어 제자리에 고정합니다. 2-3 밀리리터의 멸균 초음파 젤을 변환기에 놓습니다. 초음파 젤로 덮인 프로브를 초기 이미징을 위해 마우스 전방 흉벽의 소독 된 부분에 수직으로 놓고 무균 상태를 유지합니다.
앞에서 설명한 대로 초음파 이미지를 보고 최적화합니다. 횡단면에서 마우스의 앞쪽 가슴을 스캔하려면 변환기를 수직으로 잡고 붓 모양 또는 쓸어 넘기는 동작으로 목에서 복부까지 위아래로 움직입니다. 심장이 시야 중앙에 오도록 하여 변환기를 목 쪽으로 약간 쓸어넘깁니다.
가슴 위쪽의 양쪽에 있는 두 개의 둥근 쌍을 이루는 검은색 구조를 주목하십시오. 초음파 프로브를 사용하여 일반적으로 주사에 이상적인 표적 부위 인 흉선의 가장 넓은 부분을 찾습니다. 선택한 위치에서 수평 바늘 궤적을 예상하고 이 위치에서 주요 혈관이 어디에 있는지 확인합니다.
이 혈관은 주사하는 동안 피해야합니다. 혈관은 저 에코 박동성 구조가 될 것입니다. 확실하지 않은 경우 화면의 색상 버튼을 눌러 컬러 도플러 모드를 활성화하여 용기 내부의 흐름을 확인하십시오.
한 손에는 변환기를 잡고 다른 한 손에는 30마이크로리터의 주사제가 있는 10게이지 인슐린 바늘을 잡습니다. 주입 과정을 시작하려면 흉선이 초음파 시야에서 중심에서 벗어나도록 변환기를 옆으로 움직입니다. 시야의 다른 쪽이 대부분 초음파 젤로 구성되어 있는지 확인하십시오.
변환기 아래의 젤에 바늘 끝을 놓고 바늘이 피부 표면에 인접하여 시각화 될 때까지 바늘을 천천히 움직입니다. 초음파 하에서 바늘을 지속적으로 이미징하면서 혈관에서 떨어진 경피적 궤적으로 흉선에 바늘을 삽입하십시오. 교차 흉선 수평 궤적을 사용하여 바늘 끝을 진입 부위의 반대쪽 흉선 엽에 놓습니다.
바늘 끝이 흉선의 원하는 부분 안에 있으면 초음파 시각화를 사용하면서 30게이지 주사기의 내용물을 빠르게 주입합니다. 바늘 삽입 및 주입 중에 주사기를 안정화하려면 엄지와 세 번째 손가락 사이에 주사기를 잡고 집게 손가락으로 주사기 플런저를 제어합니다. 모든 내용물이 입금 된 후 바늘을 제거하십시오.
어린 생쥐에서는 흉선의 크기가 크기 때문에 흉선을 식별하는 것이 간단했습니다. 나이가 많거나 면역 결핍 마우스에서 더 어려웠습니다. 그러나 현대 초음파 장비로는 여전히 실현 가능했습니다.
성공적인 주사는 바늘이 심장, 대동맥 또는 하대 정맥 중 하나와 같은 중요한 구조를 통과하지 않을 때 나타났습니다. 바늘 끝은 주사 동안 목표 위치에서 시각화되어 흉선 내 침착을 확인했습니다. 주사의 흉선 내 위치는 루시페린을 루시페라아제 형질전환 마우스에 주사액으로 사용하여 확인하였다.
이들은 생물 발광 영상으로 즉시 평가되어 동물을 희생하지 않고 주사의 정확한 위치를 확인했습니다. 또는, Trypan Blue는 부검과 함께 ex vivo를 사용하여 주사 부위 및 주입 정확도의 시각적 마커로 주입되었습니다. 우리 그룹은 유전자 변형 전구 세포의 주입을 기반으로 한 암 면역 요법 연구를 포함한 여러 대규모 연구와 면역 결핍 마우스의 흉선 기능 개선에이 기술을 사용해 왔습니다.
