O protocolo fornece uma alternativa não cirúrgica precisa, segura e eficiente aos métodos tradicionais de injeção cirúrgica e cega. É também a técnica de injeção mais precisa para timos atrofiados em camundongos idosos ou imunodeficientes. A principal vantagem é um procedimento de injeção minimamente estressante que é muito seguro e preciso, mas também rápido, permitindo assim experimentos em larga escala sem comprometimento de dados da imunossupressão relacionada ao estresse cirúrgico.
Manter o alinhamento da agulha e do transdutor enquanto avança através da parede torácica requer alguma prática. Portanto, recomendamos colaborar com um radiologista intervencionista experiente para realizar injeções ou fornecer treinamento. Ajudando a demonstrar o procedimento estará Shaina Anuncio, uma técnica do meu laboratório.
Para começar, aplique uma fina camada de creme depilatório na área anterior do tórax dos ratos por menos de um minuto para remover a pele. Use uma toalha de papel molhada para remover o creme e a pele solta. Confirme a profundidade anestésica apropriada por falta de resposta à pinça da pata traseira.
Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar a secagem da córnea. Coloque um rato de cada vez na posição supina na plataforma aquecida da estação de imagem de ultrassom de pequenos animais com o cone do nariz no lugar. Prenda o rato ao palco com fita adesiva médica nos membros posteriores e dianteiros.
Desinfete a pele do tórax superior sem pelos usando um aplicador de gluconato de clorexidina . Ative a sonda linear de frequência mais alta disponível. Normalmente, a sonda com a maior resolução espacial para o tamanho do animal que está sendo fotografado.
Ative a sonda tocando no botão correspondente após a tela de inicialização. Para otimizar as configurações de ultrassom para imagem e injeção, ajuste a profundidade do campo de visão para um tamanho apropriado para o animal alvo, ajustando os controles deslizantes orientados verticalmente no lado direito da tela. Ajuste o ganho de escala de cinza deslizando o botão ao longo da barra horizontal na parte inferior da tela.
Em seguida, ajuste a zona focal para o nível previsto do timo. Aplique cerca de um mililitro de gel de ultrassom na superfície do transdutor enquanto estiver ereto, descansando no suporte da máquina de ultrassom ou nas mãos de um assistente. Para preparar um pequeno campo estéril ao lado da plataforma aquecida, esvazie uma tampa de sonda estéril, elástico, luvas estéreis e gel de ultrassom estéril no campo estéril.
Em seguida, coloque as luvas estéreis. Coloque cuidadosamente a tampa da sonda estéril sobre o transdutor de ultrassom e o gel. Para manter a esterilidade, toque apenas na tampa estéril.
Deslize o elástico estéril sobre a tampa da sonda para mantê-lo no lugar. Coloque dois a três mililitros de gel de ultrassom estéril no transdutor. Coloque a sonda com tampo de gel de ultrassom verticalmente na porção desinfetada da parede torácica anterior do camundongo para a imagem inicial, mantendo a esterilidade.
Visualize e otimize a imagem de ultrassom como demonstrado anteriormente. Para escanear o tórax anterior do rato em um plano transversal, segure o transdutor verticalmente e mova-o para cima e para baixo do pescoço para o abdômen em um movimento semelhante a um pincel ou varredura. Com o coração centrado no campo de visão, varra o transdutor ligeiramente em direção ao pescoço.
Observe as duas estruturas pretas emparelhadas redondas em ambos os lados da parte superior do tórax. Usando a sonda de ultrassom, localize a porção mais larga do timo, que geralmente é o local alvo ideal para a injeção. Antecipe uma trajetória horizontal da agulha no local escolhido e observe onde os principais vasos sanguíneos estão localizados neste local.
Estes vasos devem ser evitados durante a injeção. Os vasos sanguíneos serão estruturas pulsáteis hipoecóicas. Se não tiver certeza, ative o modo Doppler colorido tocando no botão de cor na tela para verificar o fluxo dentro dos vasos.
Segure o transdutor com uma mão e uma agulha de insulina de calibre 30 com 10 microlitros de injeção na outra. Para iniciar o processo de injeção, mova o transdutor lateralmente para que o timo fique fora do centro no campo de visão do ultrassom. Certifique-se de que o outro lado do campo de visão consiste principalmente em gel de ultrassom e nada mais.
Coloque a ponta da agulha no gel sob o transdutor e mova lentamente a agulha até que ela seja visualizada adjacente à superfície da pele. Ao fotografar continuamente a agulha sob ultrassom, insira a agulha na glândula timo com uma trajetória percutânea longe dos vasos sanguíneos. Use uma trajetória horizontal do timo cruzado para colocar a ponta da agulha no lobo tímico contralateral ao local de entrada.
Uma vez que a ponta da agulha esteja dentro da porção desejada do timo, injete rapidamente o conteúdo da seringa de calibre 30 enquanto usa a visualização ultrassonográfica. Para estabilizar a seringa durante a inserção e injeção da agulha, segure a seringa entre o polegar e o terceiro dedo e controle o êmbolo da seringa com o dedo indicador. Remova a agulha depois de todo o conteúdo ter sido depositado.
Em ratos jovens, a identificação da glândula timo foi simples devido ao grande tamanho da glândula. Foi mais desafiador em camundongos mais velhos ou imunodeficientes. No entanto, ainda era muito viável com modernos equipamentos de ultrassom.
A injeção bem-sucedida foi observada quando a agulha não atravessou estruturas críticas, como o coração, a aorta ou uma das veias cavas inferiores. A ponta da agulha foi visualizada em sua localização alvo durante a injeção, confirmando a deposição intratímica. A localização intratímica da injeção foi confirmada usando Luciferin como um injetado em camundongos transgênicos com luciferase.
Estes foram avaliados imediatamente com imagens de bioluminescência, confirmando a localização correta da injeção sem sacrificar o animal. Alternativamente, Trypan Blue foi injetado como um marcador visual do local de injeção e precisão da injeção usando ex vivo com necropsia. Nosso grupo tem usado essa técnica para vários grandes estudos, incluindo pesquisas de imunoterapia contra o câncer, com base na injeção de células progenitoras geneticamente modificadas, e para melhorar a função tímica em camundongos imunodeficientes.
