Синаптонемальный комплекс является ключевым компонентом мейоза. Чтобы изучить его функцию, мы должны также понять его структуру, для которой микроскопия сверхвысокого разрешения оказалась невероятно полезной. Мы оптимизировали наш протокол для стабильного прикрепления иммуноокрашенной гонады C.elegans к крышке, которая помогает улучшить разрешение до 30 нанометров в неповрежденных тканях.
Проектирование экспериментов по микроскопии локализации одной молекулы, последующий анализ, а также интерпретация данных могут быть довольно сложными и должны быть лучше всего настроены вместе с экспертом. Демонстрировать процедуру будет Ивана Кавка, докторант лаборатории. Получение микроскопических изображений локализации одной молекулы также будет показано Рори Пауэром, инженером-оптиком из Центра визуализации MBL.
Начните с сбора соответствующих возрасту червей Caenorhabditis elegans из агаровых пластин NGM. Переведите червей в 30-микролитровую каплю EBTT на крышке. Промыть червей дополнительными 30 микролитрами EBTT.
Удалите 30 микролитров раствора, оставив 30 микролитров капли с червями на крышке. Используйте лезвие скальпеля, чтобы отрезать головы червей и / или хвосты, чтобы выдавить гонаду. При успешном рассечении ткань гонады будет полностью экструдирована вне тела червя.
Пипетка 30 микролитров фиксирующего раствора в каплю рассеченных червей. Перемешайте путем пипетки и оставьте образцы для фиксации на одну минуту. Остановите фиксацию ровно через одну минуту, перенеся червей с помощью 20-микролитровой пипетки на ПЦР-трубку, заполненную TBST.
Затем выполните промывку, вращая рассеченные образцы на мини-настольной центрифуге. Как только супернатант удален, повторно суспендируйте червей в 200 микролитрах свежего TBST. После окончательной промывки повторно суспендируйте червей в 200 микролитров ПБСТ и поместите трубку ПЦР на лед.
Раскрутите рассеченные образцы на мини-настольной центрифуге и удалите супернатант. Добавьте от 50 до 100 микролитров холодного метанола, перемешайте путем пипетки и оставьте образцы в метаноле на 30-60 секунд на льду. Дважды промыть образцы 200 микролитрами ПБСТ.
После вращения образцов и удаления супернатанта добавьте блокирующий раствор к образцам и держите его при комнатной температуре в течение 45-60 минут. Разводят первичные антитела к рабочим растворам в блокирующем буфере. Раскрутите образцы на мини-настольной центрифуге, удалив блокирующий раствор, и добавьте от 30 до 50 микролитров раствора первичного антитела.
Насиживают на ночь при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации промыть образцы три раза в ПБСТ. Разбавьте меченые Fab простые два фрагмента до рабочих растворов в блокирующем буфере.
После третьей промывки раскрутите образцы вниз, удалите супернатант и добавьте от 30 до 50 микролитров раствора вторичных антител. Поместите образец в темную камеру и инкубируйте в течение 30 минут до двух часов при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах Цельсия. Затем промывайте образцы три раза ПБСТ в течение пяти-15 минут.
Раскрутите окрашенные образцы и удалите супернатант. Добавьте 50 микролитров PBST и переложите окрашенных червей на крышку. Пипетка от 5,7 до 6,3 микролитров постфиксативного раствора на поли-l-лициновую крышку.
Пипетки снимают рассеченных червей в том же объеме и переносят в каплю фиксатора на поли-l-лизиновой крышке. Накройте образец небольшим чехлом. Удалите лишнюю жидкость с помощью небольшого кусочка фильтровальной бумаги и зафиксируйте образец на три-пять минут в темной камере.
Заморозьте образцы, поместив их на алюминиевый блок в сухой лед. По крайней мере, через 20 минут удалите меньшую крышку с помощью бритвы. Окуните крышку в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую ледяной PBS или метанол, охлажденный при минус 20 градусах Цельсия, в течение примерно 10 секунд.
Поместите крышку в колодец из шестилуночной пластины, заполненной буфером PBST. Извлеките ПБСТ из колодца, добавьте свежий ПБСТ и оставьте образец на пять минут. После промывки PBST еще раз оставьте образцы при четырех градусах Цельсия до получения изображения.
Перед визуализацией оцените качество крепления образца под стереомикроскопом. При использовании изготовленного на заказ держателя образца, показанного здесь, оберните магнитное кольцо парапленкой, а затем подготовьте один миллилитр буфера визуализации. Возьмите крышку с шестилуночной пластины.
Поместите его в изготовленный на заказ держатель и закрепите крышку в держателе с помощью магнитного кольца, обернутого парапленкой. Аккуратно пипеткуйте буфер визуализации в камере, созданный магнитным кольцом поверх образца, и герметизируйте камеру с помощью парапленки. Чтобы смонтировать образец, добавьте одну каплю погружного масла в объектив чистого масла.
Не вводя воздуха в погружное масло, аккуратно поместите держатель образца с установленным образцом на ступень микроскопа. Используя окно плагина EMU в MicroManager 2, перемещайте пьезо-стадию до тех пор, пока сигнал от лазера блокировки фокусировки не будет обнаружен на квадрантном фотодиоде. Получение изображения задней фокальной плоскости с меньшей мощностью с помощью лазера при возбуждении 640 нанометров для подтверждения отсутствия пузырьков воздуха в погружном масле.
Локализуйте ткань гонады с помощью яркого освещения. Используя освещение низкой интенсивности в 640 нанометров, сосредоточьтесь на участке ткани, содержащем множество синаптонемальных комплексов. Приступайте к экспонированию образца при высоком излучении с освещением на 640 нанометров в течение примерно 30 секунд до тех пор, пока не будет достигнута соответствующая скорость моргания.
Получайте 200 000 кадров со временем экспозиции 20 миллисекунд с помощью многомерного инструмента сбора в MicroManager 2. Между тем, настройте УФ-активацию, используя опцию активации плагина EMU для поддержания желаемой скорости мигания. Самая нижняя плоскость мейотических ядер, содержащих синаптонемальные комплексы, была визуализирована в гонаде Caenorhabditis elegans с использованием окрашивания HTP-3 и SYP-5.
Оси хромосом в С-конце SYP-5 HA были хорошо разрешены во всех трех измерениях в синаптонемальных комплексах, расположенных близко к покровному листу. Однако разрешение ухудшается в синаптонемальных комплексах, расположенных на расстоянии пяти микрометров от покровного листа из-за рассеяния света и сферических аберраций. Изображения, полученные на разных пьезодальностях от покровного листа, показали, что изображенная ткань не должна находиться дальше двух микрометров от покровного листа.
Протокол пробоподготовки также может быть использован с микроскопией TauSTED. При оптимизированной пробоподготовке HTP-3 в оси хромосом и C-термины SYP-5 в центральной области были разрешены в лобовом обзоре и слегка наклоненном виде. Чтобы получить наилучшее разрешение, гонады должны быть плотно сшиты с крышкой, чтобы гарантировать, что синаптонемальные комплексы находятся не дальше двух микрометров от крышки.
Мы используем этот протокол не только для микроскопии локализации одной молекулы, но и для микроскопии замедленного истощения эмиссии. Это также может быть полезно для других методов микроскопии со сверхвысоким разрешением.
