Этот протокол описывает методы визуализации дендритных морфологий позвоночника и переходных процессов кальция в нейронах C.elegans. Наш подход должен способствовать генетическим подходам к обнаружению детерминант морфогенеза и функции позвоночника. Наш протокол включает дендритные шипы в ГАМКергических нейронах.
Шипы в других классах нейронов C.elegans также могут быть исследованы с помощью этих методов. Наш протокол описывает методы иммобилизации живых C.elegans. Особенно важно предотвратить движение животных во время получения изображения и выбрать правильные лазерные конфигурации для возбуждения и записи активности нейронов.
Чтобы получить изображения с высоким разрешением, добавьте три микролитра раствора анестетика и обобщите от 15 до 20 молодых взрослых червей на 10% агарозных подушечках. Затем нанесите крышку, чтобы обездвижить червей, и запечатайте края крышки расплавленной клейкой герметизирующей смесью. Для получения сверхвысокого разрешения используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный микроскопией сверхвысокого разрешения.
Приобретайте Z-стеки, используя размер шага, рекомендованный программным обеспечением производителя. Соберите серию оптических секций, которые охватывают общий объем дорсального D или DD вентрального процесса. Отправляйте Z-стеки для обработки изображений с помощью программного обеспечения производителя и анализируйте изображения с оценкой выше семи.
Для получения Найквиста используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп и выберите оптимальный размер пикселя для длины волны света и числовой диафрагмы объектива. Затем отправьте стек для 3D-деконволюции с помощью автоматического алгоритма. Для анализа изображений используйте соответствующее программное обеспечение для обработки изображений для создания проекций максимальной интенсивности стеков Z.
И вручную подсчитать выступы на дендрите DD. Затем определяют длину набранного дендрита DD для расчета плотности шипов на 10 микрометров дендрита DD. Затем классифицируйте колючки как тонкие или грибные, филоподиальные, корявые или разветвленные.
Используя обычные методы, такие как микроинъекция, создают трансгенных червей, экспрессирующих датчик кальция GCaMP в нейронах DD, и Chrimson, родопсин с красным смещением в пресинаптических нейронах VA. Затем, под ламинарной вытяжкой, подготовьте все трансретинальные или ATR пластины, добавив 300 микролитров выращенной ночью бактериальной культуры OP50 и 0,25 микролитра ATR к каждой 60-миллиметровой питательной агаровой пластине нематодной среды. Затем выкладываем культуру стерильным стеклянным стержнем.
Для контрольных пластин добавьте 300 микролитров бактерий OP50 и 0,25 микролитра этанола. Чтобы обеспечить рост бактерий, инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 24 часов, защищенные от окружающего света. Чтобы начать эксперимент, поместите пять личинок стадии L4 на OP50-засеянные ATR или контрольные пластины и инкубируйте пластины в темноте при 23 градусах Цельсия.
Через три дня используйте стереопарирующий микроскоп для подтверждения развития вульвы и выберите потомство стадии L4 из ATR и контрольных пластин для визуализации. Затем поместите два микролита полигранул размером 0,05 микрометра на предметное стекло микроскопа. И поместите в раствор примерно 10 личинок L4.
Используя платиновую проволоку, добавьте в раствор небольшую шарик суперклея. Осторожно закрутите раствор, чтобы образовать нитевидные нити клея. Затем добавьте три микролитра буфера M9.
Затем нанесите крышку и запечатайте ее края, как показано ранее. Чтобы записать вызванные переходные процессы кальция в дендритных шипах, используйте вращающийся дисковый конфокальный микроскоп и отрегулируйте стадию микроскопа, чтобы расположить шипы DD в фокальной плоскости. Затем настройте покадровое получение для освещения образца 488-нанометровой лазерной линией в каждом кадре для обнаружения флуоресценции GCaMP и 561-нанометровой лазерной линией с периодическими интервалами для возбуждения Кримсона.
Для визуализации кальция in vivo используйте 2D-деконволюцию и выравнивание изображения для коррекции незначительных отклонений от движения червя во время захвата. Затем определите дендритный позвоночник DD как область интереса или ROI. Продублируйте ROI и переместите его в соседний регион внутри червя, чтобы собрать фоновый сигнал.
Затем, используя соответствующее программное обеспечение, экспортируйте интенсивность GFP в Excel для каждой точки времени и вычтите фоновую флуоресценцию из флуоресценции ROI позвоночника. Определите изменение флуоресценции, вычитая флуоресценцию GFP в кадре непосредственно перед 561-нанометровым возбуждением или при нуле из каждой точки времени после возбуждения или дельты F. Затем разделите на F ноль, чтобы определить дельту F над F нулем. И график нормализованных следов.
Во-первых, определите, обычно ли данные распределены, используя тест Шапиро-Уилка. Для данных, которые обычно не распределяются, используйте непараметрическую ANOVA с пост-специальной коррекцией для многократного тестирования. В качестве альтернативы, для измерений, показывающих нормальное или гауссово распределение, выполняют парный параметрический тест ANOVA для каждого измерения флуоресценции GCaMP до и после каждого 561-нанометрового импульса.
И правильно для нескольких сравнений в каждой из двух групп. Маркировка дендритных шипов DD с тремя независимыми маркерами, цитозольной mCherry, MYR: mRuby и LifeAct: GFP дала среднюю плотность 3,4 дендритных шипов DD на 10 микрон дендрита DD у молодых людей дикого типа. Маркер GFP: Utrophin был исключен из этого анализа, потому что он дал значительно более низкую плотность позвоночника, потенциально из-за взаимодействия утрофина с актиновым цитоскелетом, который управляет морфогенезом позвоночника.
Подход к визуализации живых клеток подтвердил, что тонкая грибовидная морфология шипов DD преобладает у взрослого человека по сравнению с альтернативными формами позвоночника, такими как филоподиальная, короткая и разветвленная. Активация дендритных шипов DD оценивалась пресинаптической холинергической сигнализацией у трансгенных червей, экспрессирующих GCaMP в нейронах DD, и Chrimson в пресинаптических нейронах VA. Переходные всплески сигнала GCaMP были обнаружены в позвоночниках DD сразу после оптогенетической активации Хримсона в пресинаптических нейронах VA.
Контрольный эксперимент в отсутствие ATR подтвердил, что измерение сигнала GCaMP зависит от оптогенетической активации Хримсона, которая строго зависит от ATR. Чтобы визуализировать шипы DD, лучше всего изобразить животных, лежащих на боку, таких как шипы, которые выступают, находятся под прямым углом к световому пути. С помощью этого метода ученые также могут использовать фармакологические манипуляции, чтобы понять механизмы, которые управляют переходными процессами кальция в позвоночниках DD.
