Разработанная нами технология эпигенетического молчания относится к более широкой области технологий, которые являются технологиями подавления генов. До того, как мы начали разрабатывать потребность в эпигенетическом подавлении, в этой области существовало две альтернативы. Один из них — нокдаун генов РНК-интерференцией, а другой — разрушение генов искусственными нуклеазами.
А разрушение генов искусственными нуклеазами работает на уровне ДНК. Итак, у вас есть ген-мишень, который вы хотите инактивировать, и вы доставляете в клетку несколько искусственных нуклеаз, которые вызывают разрыв двойной нити. Этот вид разрыва двойной струны может привести к дегенеративной сумме, мутации со сдвигом фрейма, которые в конечном итоге приводят либо к дегенерации нефункционального белка, либо к одновременной транскрипционной деградации.
Таким образом, эпигенетическое молчание работает, доставляя клетке, так называемые инженерные репрессоры транскрипции. Это небольшие белки, которые способны связываться с ДНК-мишенью, а затем накладываться только на ген-мишень, так называемый эпигенетический маркс. Это некая химическая модификация, которая, попав на ДНК, может привести к уплотнению хроматина.
Важно отметить, что уплотнение хроматина приводит к ингибированию транскрипции, поэтому у вас больше нет экспрессии гена-мишени. И что очень важно, такого рода транскрипционно-репрессивное состояние может длительно объединяться клетками. Чтобы идентифицировать клеточные линии, экспрессирующие ген-мишень, который необходимо заглушить, просмотрите ген-мишень в Атласе белков человека и перейдите по разделу «Клеточные линии», чтобы определить клеточные линии, представляющие интересующую соматическую ткань.
Из идентифицированных клеточных линий отдайте приоритет тем, для которых доступны эффективные протоколы доставки транзиторных генов. Затем откройте средство просмотра генов и определите область гена-мишени для интеграции кассеты экспрессии флуорофора. Затем используйте CHOPCHOP для идентификации и выбора GNRA, которая будет разрезать целевую область в первом интроне гена Beta-2M.
Затем разработайте донорский шаблон для сайта разреза GNRA, состоящий из левого плеча гомологии, кассеты экспрессии трансгена без промотора и правой группы гомологии. Доставьте нуклеазную систему CRISPR Cas9 и донорский шаблон внутрь клеточной линии K-562 с помощью нуклеофекции в соответствии с инструкциями производителя. Культивируйте клетки К-562 не менее 14 дней.
Контролируйте уровни экспрессии флуоресцентного репортера с течением времени с помощью проточного цитометра. Активируйте эфириновый канал FICO для измерения интенсивности флуоресценции репортера tdTomato. Просмотрите ген-мишень в UCSC Genome Browser и извлеките нуклеотидную последовательность областей, которые потенциально регулируют его транскрипционную активность, таких как островки CpG и сайты, обогащенные для ацетилирования H3K27.
Вставьте выбранные последовательности в онлайн-инструмент CHOPCHOP и выберите вытеснение в качестве цели GNRA, которые необходимо получить. CHOPCHOP предоставит список GNRA, нанесенных на карту по интересующей генетической последовательности и перечисленных в соответствии с оценкой, учитывая количество нецелевых совпадений и прогнозируемую эффективность на мишени. Выберите не менее 10 GNRA для каждой целевой последовательности.
Попробуйте выбрать GNRA, охватывающие всю область, для интеграции без полных совпадений с другими межгенными последовательностями по всему геному. После трансформации плазмид, кодирующих ETRS, в химически компетентные клетки E.coli, проводят скрининг колоний на наличие плазмиды, содержащей ETR, путем расщепления ферментом рестрикции и секвенирования по Сэнгеру. Чтобы клонировать GNRA внутри магистрали phU6 GNRA, сначала сгенерируйте олиго с помощью программного обеспечения для молекулярной биологии.
Добавьте пятинуклеотидную последовательность перед протоспейсером и пометьте эту 25-нуклеотидную олиго. Точно так же добавьте пятинуклеотидную последовательность обратного комплемента прото-спейсера и цитозин после него, чтобы получить олиго длиной 25 нуклеотидов и пометить его. Синтезируйте эти олиго в виде бессолевого одноцепочечного ДНК-олиго, ресуспендированного в воде при 100 микромолярах.
Добавьте по одному микролитру каждого олиго к двум микролитрам буфера для отжига и 16 микролитрам воды. Выполните олигоотжиг, поместив раствор в амплификатор при температуре 95 градусов Цельсия на 10 минут. Затем постепенно остудите до 25 градусов Цельсия в течение 45 минут.
Разбавьте один микролитр отожженных олигов 99 микролитрами воды, не содержащей нуклеаз. Затем лигируют один микролитр этого разведения 50 нанограммами плазмиды phU6 GNRA, предварительно расщепленной ферментом рестрикции Bsa1. Трансформировали 20 микролитров химически компетентных клеток E.coli двумя микролитрами продукта лигирования.
Выберите несколько колоний для производства плазмидной ДНК и подтвердите успешное клонирование протоспейсера с помощью секвенирования по Сэнгеру. Чтобы доставить DTR на основе GNRA и CRISPR dCas9 в репортерную клеточную линию в массиве, сначала подготовьте отдельные пробирки, содержащие по 500 нанограммов каждой из плазмид, и добавьте 125 нанограммов различных плазмид, кодирующих GNRA для тестирования. Включите состояние нуклеофекции без GNRA и ETR в качестве образца, обработанного имитационной обработкой.
Подготовьте не менее трех технических копий для каждого образца. Гранулируйте пять раз по 10 до пятой клетки Beta-2M tdTomato K-562 на пробирку и наклейте на них смесь плазмид. Ресуспендируйте клетки в 200 микролитрах предварительно нагретой среды для культивирования клеток млекопитающих RPMI 1640 и поместите их в инкубатор.
Используйте проточную цитометрию для измерения процента молчащих клеток в разные моменты времени после доставки ETR. Используйте клетки дикого типа без последовательности покрытия Flora 4. Установить порог репортерных отрицательных ячеек.
Используйте имитацию обработанного образца, чтобы задать шлюз для репортерных положительных ячеек. Определите три основных GNRA с точки зрения долгосрочной эффективности глушения. Используйте факты для отбора репортерных отрицательных субпопуляций, стабильно сохраняющихся в этих выборках.
Кроме того, проверьте факты пробных образцов, обработанных при той же обработке, чтобы обеспечить надлежащее сравнение при последующих анализах. Флуоресцентный репортер tdTomato был интегрирован в первый интрон гена Beta-2M человека с помощью CRISPR Cas9, индуцированной томологической направленной репарацией. Репортерные положительные клетки К-562 появляются в обработанном образце после интеграции.
При переходной доставке тройной комбинации ETR вместе с GNRA был проведен анализ продольной проточной цитометрии для оценки экспрессии флуоресцентного репортера. Пик репортерной репрессии наблюдался при остром анализе, который частично реабсорбировался из-за митотического разведения ETR-кодирующих плазмид с течением времени. Эффективное осаждение метилирования CpG на локусе-мишени комбинацией GNRA ETR было очевидно по постоянному подавлению репортера в значительной части обработанных клеток.
Различные GNRA показали различную долгосрочную эффективность глушения. Одним из наиболее ключевых шагов в достижении постоянного и эффективного подавления эпигенома является идентификация эффективной одиночной гРНК. Для того, чтобы сделать это любым видом применения, нужно начать с определения наиболее отзывчивых последовательностей, в том числе промоторных и ответных в любых других сайтах для транскрипционных регуляторов.
После определения того, какая область может быть наиболее отзывчивой и эффективной, любой человек должен разработать другой вид теста на одну гРНК в виде отдельного теста или комбинации одной гРНК. Одним из наиболее очевидных применений редактирования эпигенома, безусловно, является доклиническая трансляция при любом усилении функциональной мутации, при которой подавление этого гена может быть полезно для лечения конкретных заболеваний. С другой стороны, мы должны иметь в виду, что способность специфически изменять эпигенетическую регуляцию данного промотора может быть очень полезным инструментом как для клинической, так и для фундаментальной трансляционной науки.
