Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, такие как механизмы регуляции генов и причины и следствия отношения между различными элементами регулирования хроматина. Основным преимуществом этой методики является то, что впервые можно модулить хроматиновые локусы с физиологически релевантными эндогенными ферментами. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что мышь ESL культуры по своей сути трудно для тех, кто не был обучен технике.
Дальнейшая демонстрация этого метода имеет решающее значение, как клеточная вирусная инфекция шаги трудно узнать. Исследователь должен приутомить две отдельные линии клеточной культуры и необходимо внимательно следить за безопасностью во время этих шагов. Для начала протокола, прохождение 18 миллионов 293T HEK клеток на 50 сантиметров пластины.
Аспирировать старые средства массовой информации и добавить 10 миллилитров одного X фосфат буфера солевого раствора, или PBS. Аспирировать PBS и добавить три миллилитров 0,05%трипсина. Инкубировать клетки в трипсине в течение восьми минут при 37 градусах по Цельсию.
Рок и нажмите клетки на полпути через инкубацию. На следующий день, когда клетки достигли 60 до 80% слияния, выполнить полиэтиленимин, или PEI, трансфекции. Затем аккуратно смешайте ДНК, PEI и трансфекцию в 15 миллилитровой конической трубке.
Инкубировать образец при комнатной температуре в течение 15 минут. После инкубации добавьте раствор в 15-сантиметровую пластину. Затем инкубировать образец в течение 16 часов в 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%углекислого газа.
На следующий день, аспирировать средства массовой информации и аккуратно заменить его на довоенные, свежие 293 HEK средств массовой информации на 15 сантиметров пластин. После обмена средствами массовой информации, инкубировать клетки в 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%углекислого газа в течение 48 часов. Подсчитайте клетки с гемоцитометром.
Прохождение ранее подготовленных mESC в 12 хорошо пластины формата с 100000 клеток на колодец за день до заражения. Для клеток, выращенных в формате 10 сантиметров, аспирировать старые средства массовой информации, добавить пять миллилитров одного X PBS, аспирировать PBS, и добавить один миллилитр 0,25% трипсина. Инкубировать клетки в трипсине в течение восьми минут при 37 градусах по Цельсию и рок и нажмите клетки на полпути через инкубацию.
Через 48 часов после обмена средствами массовой информации удалите и перенесите супернатант клеток 293T HEK в 50 миллилитровую коническую трубку. Центрифуга супернатант на 300 раз G в течение пяти минут, чтобы гранулировать клеточный мусор. Затем фильтруй супернатант через мембрану 0,45 микрона.
Сосредоточьте вирус с помощью ультрацентрифуга с ротором SW32 и вращай образец на 72 000 раз G в течение двух с половиной часов при четырех градусах Цельсия. В то время как вирус концентрируется под ультрацентрифугации, лечить ЦРУ mESC в 12 хорошо пластины со свежим эмбриональным стеблем или ES средств массовой информации, содержащие пять микрограммов на миллилитр полибрена. Когда концентрация вируса закончилась, тщательно аспирировать супернатант и тщательно приостановить вирус гранулы в 100 микролитров одного X PBS, чтобы избежать лишних пузырьков.
Добавьте вирус и один X PBS в 1,5 миллилитровую трубку Microfuge. Vortex трубки в самой низкой настройке, чтобы полностью приостановить вирус. Спин вниз трубку в мини столешнице центрифуги в течение пяти до 10 секунд, чтобы удалить пузырьки.
Добавьте 30 микролитров вируса к каждому колодец из 12 пластин хорошо. Закружить пластину, а затем центрифугу образцов на 1000 раз G в течение 20 минут. Поместите 12 хорошо пластины обратно в 37 градусов по Цельсию инкубатор на ночь.
На следующее утро, обмен средствами массовой информации со свежими средствами массовой информации ES и позволяют инфекции иметь место в течение 48 часов. После 48 часов инфекции, выберите для клеток, которые интегрированы вирусной плазмиды, добавив соответствующий антибиотик. Изменение средств массовой информации ежедневно.
Держите средства отбора на клетках в течение 72 до 96 часов в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5%углекислым газом. Продолжить с химическим эпигенетическим модификатором, или CEM, подготовка и лечение, приостановив порошкообразных CEM и диметил сульфоксид, или DMSO, до концентрации запасов одного миллимолара и рабочей концентрации 100 микромолей. После того, как клетки прошли отбор в течение 72 до 96 часов, разделить mESC в 12 хорошо формат с 100000 клеток на колодец.
Инкубировать клетки в 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%углекислого газа в течение 24 часов. После инкубации приготовьте медиа-решение из 100 наномолярных CEM с помощью ES-медиа. Используйте средства массовой информации, чтобы накормить ЦРУ mESC с одним миллилитров хорошо.
Держите колодец клеток без каких-либо добавленных CEM, чтобы служить в качестве контроля. Затем измените средства массовой информации, аспирируя старые средства массовой информации и добавляя один миллилитр на хорошо подготовленный CEM, содержащий или CEM бесплатные средства массовой информации ES каждые 24 часа в течение всего эксперимента. После 48 часов лечения CEM, изображение клеток без лечения CEM в клетках, обработанных 100 наномолярных CEM с помощью флуоресцентного микроскопа.
Возьмите репрезентативные изображения с помощью фазы или яркого поля для записи морфологии mESC при увеличении в 10-40 раз. Клетки должны были образоваться вокруг колоний с несколькими дифференцированными клетками. Под каналом fitC флуоресценции, изображение обеих условий клетки.
Далее, изолировать контроль и CEM лечение клеток для цитометрии потока путем аспирации средств массовой информации, мыть клетки с одним миллилитром одного X PBS, аспирации PBS и добавить 0,25 миллилитров 0,25%трипсина с ЭДТА в течение восьми до 10 минут. Подтвердите, что клетки больше не сгруппированы в большие сгустки через микроскоп, используя 20 раз увеличение. Если клетки, как представляется, не в одной клеточной подвески, осторожно пипетки их вверх и вниз с P1000 пипетки полностью trypsinize клеток.
Утолить трипсин с одним миллилитром свежих средств массовой информации и повторного перерасхода клеток на высокой скорости с серологической пипетки, пока клетки находятся в одной клеточной подвески. Затем, спина вниз клетки в 300 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант, мыть клетки с одним X PBS, и центрифуга клеток.
Аспирировать супернатант PBS и повторно поместью клеточной гранулы в 200 микролитров буфера FACS. Выполняем цитометрию потока примерно на 50 000 клеток с подвешенными клетками и запускаем образцы со скоростью оболочки около 5000 клеток в секунду. Наконец, экспортировать данные для дальнейшего анализа.
Фазовые изображения системы CEM в локусе Oct4 и mESC ЦРУ изображены после 48 часов лечения 100 наномолярами CEM23 или с необработанными клетками указывают на конкретные репрессии GFP. Флуоресцентные изображения показывают яркое выражение GFP в контрольных ячейках и уменьшенное выражение GFP в MESC, обработанном CEM23. Цитометрия потока постоянно выявила более чем 30%-ное снижение экспрессии GFP в MESC ЦРУ, обработанном 100 наномоляром CEM23 в течение 48 часов.
Хроматин иммунопреципиентации, или CHIP, упивался, что 48 часов лечения с 100 наномоляр ceM23 снизил уровень H3K27ac на целевой локус по сравнению с контрольными клетками. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы быть осторожным с мышью эмбриональных стволовых клеток. Если они различаются во время протокола, результаты будут аннулированы.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области синтетической биологии, чтобы исследовать механизмы in vivo в геноме млекопитающих.
