La tecnología de silenciamiento epigenético que desarrollamos pertenece a un ámbito más amplio de tecnologías, que son las tecnologías de silenciamiento de genes. Antes de que comenzáramos a desarrollar la necesidad de silenciamiento epigenético, había dos alternativas en el campo. Uno es la eliminación de genes por interferencia de ARN, y el otro fue la disrupción de genes por nucleasas artificiales.
Y la disrupción génica por nucleasas artificiales funciona a nivel de ADN. Así que tienes tu gen diana que quieres inactivar, y entregas a la célula algunas nucleasas artificiales, que inducen una doble ruptura de la cuerda. Este tipo de ruptura de doble cadena puede realizar la suma degeneracional, la mutación de cambio de marco, que finalmente impone la degeneración de la proteína no funcional o simultáneamente la degradación transcripcional.
Por lo tanto, el silenciamiento epigenético funciona mediante la entrega de la célula, los llamados represores de transcripción diseñados. Se trata de unas pequeñas proteínas que son capaces de unirse a su ADN diana, y luego imponerse sólo a su gen diana, el llamado marx epigenético. Se trata de una modificación química, que una vez depositada en el ADN, puede conducir a la compactación de la cromatina.
Es importante destacar que la compactación de la cromatina conduce a la inhibición de la transcripción, por lo que ya no se tiene la expresión del gen diana. Y lo que es muy importante, este tipo de estado represivo de transcripción puede ser unido prolongadamente por las células. Para identificar las líneas celulares que expresan el gen diana que se va a silenciar, examine el gen diana en el Atlas de Proteínas Humanas y navegue por la sección Línea celular para identificar líneas celulares representativas del tejido somático de interés.
A partir de las líneas celulares identificadas, priorice aquellas para las que se dispone de protocolos eficientes de administración de genes transitorios. A continuación, abra un visor de genes e identifique la región del gen objetivo para integrar el casete de expresión de fluoróforos. A continuación, utilice CHOPCHOP para identificar y seleccionar GNRA, que cortará la región diana en el primer intrón del gen Beta-2M.
A continuación, diseñe una plantilla donante para el sitio de corte de GNRA, que consta de un brazo de homología izquierdo, un casete de expresión transgénica libre del promotor y un brazo de homología derecho. Administre el sistema de nucleasa CRISPR Cas9 y la plantilla donante dentro de la línea celular K-562 a través de la nucleofección, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cultive las células K-562 durante al menos 14 días.
Controle los niveles de expresión del indicador fluorescente a lo largo del tiempo mediante el uso de un citómetro de flujo. Active el canal de éterina FICO para medir la intensidad de fluorescencia del reportero tdTomato. Examine el gen diana en el Navegador del genoma de la UCSC y extraiga la secuencia de nucleótidos de las regiones que potencialmente regulan su actividad transcripcional, como las islas CpG y los sitios enriquecidos para la acetilación de H3K27.
Pegue las secuencias seleccionadas en la herramienta en línea CHOPCHOP y seleccione la represión como el propósito de los GNRA que se van a recuperar. CHOPCHOP proporcionará una lista de GNRA mapeados en la secuencia genética de interés y listados de acuerdo con una puntuación, teniendo en cuenta el número de coincidencias fuera del objetivo y la eficiencia prevista en el objetivo. Seleccione al menos 10 GNRA por secuencia objetivo.
Trate de seleccionar GNRA que abarquen toda la región para integrarlas sin coincidencias completas con otras secuencias intergénicas en todo el genoma. Después de transformar los plásmidos que codifican para el ETRS en células de E. coli químicamente competentes, se examinan las colonias para detectar la presencia del plásmido portador del ETR mediante la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación de Sanger. Para clonar los GNRA dentro de la columna vertebral de phU6 GNRA, primero, genere oligonucleótidos utilizando un software de diseño de biología molecular.
Agregue una secuencia de cinco nucleótidos aguas arriba del protoespaciador y etiquete este oligonucleótido largo de 25 nucleótidos. Del mismo modo, agregue una secuencia de cinco nucleótidos del complemento inverso del protoespaciador y una citosina aguas abajo del mismo, para generar un oligo largo de 25 nucleótidos y marcarlo. Sintetizar estos oligonucleótidos como oligonucleótidos de ADN monocatenario sin sal resuspendidos en agua a 100 micromolares.
Añadir un microlitro de cada oligo a dos microlitros de tampón de recocido y 16 microlitros de agua. Realice el recocido de oligonucleótidos colocando la solución en un termociclador a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Luego enfríe gradualmente a 25 grados centígrados durante 45 minutos.
Diluir un microlitro de los oligonucleótidos recocidos con 99 microlitros de agua libre de nucleasa. A continuación, ligar un microlitro de esta dilución con 50 nanogramos de plásmido phU6 GNRA, previamente digerido con la enzima de restricción Bsa1. Transformó 20 microlitros de células de E. coli químicamente competentes con dos microlitros del producto de ligadura.
Elija varias colonias para la producción de ADN plasmídico y confirme la clonación exitosa del protoespaciador mediante secuenciación de Sanger. Para entregar los DTR basados en GNRA y CRISPR dCas9 en la línea celular reportera en matriz, primero, prepare tubos separados que contengan 500 nanogramos de cada uno de los plásmidos y agregue 125 nanogramos de diferentes plásmidos codificantes GNRA para ser probados. Incluya una condición de nucleofección libre de GNRA y ETR como muestra tratada simulada.
Prepare al menos tres réplicas técnicas por muestra. Granular cinco veces 10 a la quinta célula Beta-2M tdTomato K-562 por tubo, y nucleoffectarlas con la mezcla de plásmidos. Resuspender las células en 200 microlitros de medios de cultivo de células de mamíferos RPMI 1640 previamente calentados y colocarlas en la incubadora.
Utilice la citometría de flujo para medir el porcentaje de células silenciadas en diferentes momentos después de la administración de las ETR. Utilice celdas de tipo salvaje sin la secuencia de recubrimiento de Flora 4. Para establecer el umbral de las celdas negativas del informador.
Utilice la muestra tratada simulada para establecer la puerta para las células positivas del reportero. Identifique los tres principales GNRA en términos de eficiencia de silenciamiento a largo plazo. Utilice los datos para seleccionar las subpoblaciones negativas informantes mantenidas de manera estable en esas muestras.
También realizar hechos de las muestras tratadas simuladas bajo el mismo tratamiento para permitir una comparación adecuada en análisis posteriores. Un reportero fluorescente tdTomato se integró en el primer intrón del gen Beta-2M humano mediante reparación dirigida por tomología inducida por CRISPR Cas9. Las células K-562 positivas aparecen en la muestra tratada después de la integración.
Tras la entrega transitoria de la combinación triple ETR, junto con GNRAs, se realizó un análisis de citometría de flujo longitudinal para evaluar la expresión del reportero fluorescente. Se observó un pico en la represión del reportero en los análisis agudos, que se reabsorbió parcialmente debido a la dilución mitótica de los plásmidos que codifican ETR a lo largo del tiempo. La deposición efectiva de la metilación de CpG en el locus diana por la combinación GNRA de ETR fue evidente por la represión permanente del reportero en una fracción considerable de las células tratadas.
Diferentes GNRA mostraron una eficiencia de silenciamiento variable a largo plazo. Uno de los pasos más importantes para lograr un silenciamiento permanente y eficiente del epigenoma es la identificación de un solo ARNg efectivo. Para ello, cualquier tipo de aplicación, debe comenzar con la identificación de las secuencias más sensibles, incluyendo el promotor y la respuesta en cualquier otro sitio para los reguladores transcripcionales.
Una vez identificada cuál podría ser la región más sensible y efectiva, cualquier persona debe diseñar un tipo diferente de prueba de ARNg único como individual o combinación de ARNg único. Una de las aplicaciones más obvias de la edición del epigenoma es, sin duda, la traducción preclínica en cualquier ganancia de mutación funcional, en la que el silenciamiento de este gen podría ser útil para curar enfermedades específicas. Alternativamente, deberíamos tener en cuenta que la capacidad de cambiar específicamente la regulación epigenética de un promotor dado podría ser una herramienta súper útil tanto para la ciencia clínica como para la ciencia traslacional básica.
