Секвенирование всего генома, WGS, может помочь ответить на ключевые вопросы в области устойчивости к противомикробным препаратам посредством опроса генома и идентификации молекулярных механизмов, лежащих в основе фенотипа устойчивости к противомикробным препаратам. Секвенирование мирового генома улучшает исследование ДНК, бактериальной ДНК в больших масштабах, облегчая углубленную характеристику микробов за один прогон, включая тесно связанные патогенные варианты. Секвенирование следующего поколения обеспечивает быструю идентификацию и характеристику микроорганизмов и их профиля устойчивости к противомикробным препаратам с учетом инструмента для диагностики, лечения, эпиднадзора и отслеживания источников патогенов в клиническом контексте.
Методологии секвенирования следующего поколения могут играть определяющую роль в эпиднадзоре и отслеживании источников патогенов не только в клиническом контексте, но и в экологических условиях и, что важно, в безопасности пищевых продуктов. В настоящее время это не рутинная методика. Действительно, немного процедуры все облегчит понимание того, насколько успешно они проводят эксперимент.
Продемонстрировать процедуру будет Джулисса Энсисо-Ибарра, техник по геномике нашей рабочей группы. После извлечения и количественной оценки бактериальной ДНК добавляют 2,5 микролитра буфера тегментации. Два микролитра ввода G D N A в трубке 0,2 миллилитра и перемешивают путем пипетки.
Добавьте один микролитр буфера усиления и пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать. Затем вращайте трубку при 280 G в течение одной минуты. Поместите образцы в термоциклер при температуре 55 градусов Цельсия в течение пяти минут, а затем подержите при 10 градусах Цельсия.
Добавьте один микролитр нейтрализующего буфера в пробоотборники и аккуратно перемешайте путем пипетки. Открутите трубку и высиживайте в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее добавьте 1,7 микролитра на каждый индексный адаптер и три микролитра индексирующей мастер-смеси ПЦР.
После смешивания компонентов раскрутите при 280 г в течение одной минуты при комнатной температуре. Поместите образцы в термоциклер и выполните вторую реакцию ПЦР, как описано в рукописи. Теперь смешайте коммерческий раствор магнитных шариков путем вихря.
В соответствии с рекомендациями производителя. Перенесите маркированный или индексированный образец G D N A в новую пятимиллилитровую трубку и добавьте 0,6 микролитра магнитных шариков на каждый микролитр конечного объема образца G D N A. Аккуратно перемешайте компоненты путем пипетки и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре.
Поместите пробоины на магнитную стойку на две минуты, пока супернатант не очистится. Осторожно выбросьте супернатант, не потревожив бусины. Затем добавить 200 микролитров свежеприготовленного 80% этанола без смешивания.
Насиживайте в течение 30 секунд, пока элут не очистится, и аккуратно удалите супернатант, не нарушая бусины. Повторите эту процедуру и высушите шарики на воздухе в течение 10 минут. Теперь добавьте 15 микролитров 10-миллимолярного трис-буфера в бусины, аккуратно смешанные путем пипетки, и инкубируйте в течение двух минут при комнатной температуре.
Поместите пробирки для образцов на магнитную стойку на две минуты, чтобы супернатант очистился. После этого аккуратно перенесите 14 микролитров супернатанта из пробирки в новую 0,2-миллилитровую трубку и получите очищенную библиотеку. Разморозьте картридж с реагентами в соответствии с инструкциями производителя.
Вытяните пять микролитров нормализованной библиотеки в трубку с низким связыванием, 1,5 миллилитра и разбавьте объединенную библиотеку на четыре наномоляра с соответствующим объемом RSB. Затем добавьте пять микролитров в каждую объединенную библиотеку и 0,2 нормального гидроксида натрия в новую трубку с низким связыванием, 1,5 миллилитра. Чтобы денатурировать объединенную библиотеку на одиночные нити, перемешайте трубку путем вихря.
Открутите в течение одной минуты и высиживайте в течение пяти минут при комнатной температуре. Теперь добавьте 10 микролитров денатурированной объединенной библиотеки 990 микролитров предварительно охлажденного буфера гибридизации и аккуратно перемешайте путем пипетирования. Поместите трубку на лед до тех пор, пока не будет выполнено окончательное разбавление для загрузки секвенсора.
Налейте и подготовьте контрольную библиотеку в концентрации четырех наномоляров путем смешивания двух микролитров контрольной библиотеки и трех микролитров воды, свободной от нуклеазы. Затем добавляют по пять микролитров в каждую контрольную библиотеку и свежеприготовленные 0,2 нормальных гидроксида натрия. Денатурируйте библиотеку элементов управления на отдельные нити, как показано ранее.
Аккуратно смешайте 10 микролитров денатурированной контрольной библиотеки и 990 микролитров предварительно охлажденного буфера гибридизации путем пипетирования и поместите его на лед до окончательного разбавления для загрузки секвенсора. В новой трубке с низким связением, 1,5 миллилитра, соедините 594 микролитра денатурированной объединенной библиотеки и шесть микролитров денатурированной управляющей библиотеки. Правильно перемешайте и разбавьте конечную библиотечную смесь до конечной нагрузочной концентрации 1,2 пекомоляра в объеме 600 микролитров с использованием предварительно охлажденного буфера гибридизации.
Перед загрузкой конечной библиотечной смеси на картридж реагента выполните дополнительную термическую предварительную обработку для достижения эффективной загрузки в проточную ячейку. Инкубируйте окончательный библиотечный микс в течение двух минут при 96 градусах Цельсия. Переверните трубку, чтобы перемешать и поместите трубку на лед на пять минут.
Загрузите 500 микролитров конечной библиотечной смеси в расчетный резервуар на картридже реагента. После запуска секвенсора загрузите картридж реагента, проточную ячейку и настройте цикл секвенирования. Для анализа данных подключитесь к серверу данных виртуализации и загрузите файлы FASTQ.
Оцените исходное качество необработанных данных последовательностей с помощью стороннего программного обеспечения. Удалите остаточные последовательности адаптеров, базы низкого качества и короткие считывания из необработанных данных секвенирования. Соберите данные последовательности проверки качества на уровне contig или scaffold с помощью стороннего программного обеспечения.
Выполните аннотацию генома, отправив файл Phaster, содержащий собранный геном, на сервер RAST. Загрузите файл Phaster в Центр геномной эпидемиологии и веб-платформы Claremont для определения эпидемиологических особенностей. ARGS, VAGS и плазмиды.
Загрузите файл Phaster на сервер Phaster для идентификации последовательностей профагов. Аннотация генома выявила 5 633 кодированных признаков, из которых 5 524 являются генами белкового покрытия и 109 - последовательностями, связанными с РНК. Предсказанный штамм кишечной палочки относится к филогруппе B one и последовательности типа 40.
Был идентифицирован детерминант устойчивости к противомикробным препаратам, ген M D F A, кодирующий мультимедикатный эффлюкс широкого спектра действия. Также были идентифицированы гены, кодирующие для термостабильного энтеротоксина белок сывороточной резистентности и систему секреции третьего типа вместе с его секретируемыми эффекторными белками. Кодирующие последовательности сгруппированы в наборы функционально связанных белков, называемых подсистемами, особенно те, которые играют функциональную роль в углеводах, белках, аминокислотах и производных метаболизма и мембранном транспорте.
Надлежащая лабораторная практика имеет основополагающее значение во всем протоколе. Тем не менее, особая осторожность должна быть предпринята при обработке нескольких образцов во время подготовки секционной библиотеки ДНК, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
