يمكن أن يساعد تسلسل الجينوم الكامل ، WGS ، في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مقاومة مضادات الميكروبات من خلال استجواب الجينوم وتحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء النمط الظاهري لمقاومة مضادات الميكروبات. يحسن تسلسل الجينوم العالمي استكشاف الحمض النووي ، الحمض النووي البكتيري على نطاق واسع ، مما يسهل التوصيف المتعمق للميكروبات في جولة واحدة بما في ذلك المتغيرات المسببة للأمراض ذات الصلة الوثيقة. يوفر تسلسل الجيل التالي التعرف السريع على الكائنات الحية الدقيقة وتوصيفها وخصائصها المقاومة لمضادات الميكروبات مع الأخذ في الاعتبار أداة للتشخيص والعلاج والترصد وتتبع مصدر مسببات الأمراض في السياق السريري.
يمكن أن تلعب منهجيات تسلسل الجيل التالي دورا حاسما في مراقبة مسببات الأمراض وتتبع مصادرها ليس فقط في السياق السريري ولكن أيضا في البيئات البيئية والأهم من ذلك في سلامة الأغذية. حاليا ، هذه ليست تقنية روتينية. في الواقع ، فإن القليل من الإجراء سيجعل من السهل فهم مدى نجاحهم في إجراء التجربة.
ستوضح الإجراء جوليسا إنسيسو إيبارا ، فني الجينوم في مجموعة العمل الخاصة بنا. بعد استخراج وقياس الحمض النووي البكتيري ، أضف 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعلامات. اثنين ميكرولتر من المدخلات G D N A في أنبوب 0.2 ملليلتر وتخلط عن طريق ماصة ماص.
أضف ميكرولترا واحدا من المخزن المؤقت للتضخيم والماصة لأعلى ولأسفل للخلط. ثم قم بتدوير الأنبوب لأسفل عند 280 جم لمدة دقيقة واحدة. ضع العينات في دراجة حرارية عند 55 درجة سلزية لمدة خمس دقائق ، تليها الاحتفاظ عند 10 درجات مئوية.
أضف ميكرولترا واحدا من المخزن المؤقت المعادل إلى أنابيب العينة واخلطه برفق عن طريق السحب. قم بتدوير الأنبوب واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 1.7 ميكرولتر من كل محول فهرس وثلاثة ميكرولتر من مزيج PCR الرئيسي للفهرسة.
بعد خلط المكونات ، قم بتدويرها عند 280 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ضع العينات في العجلة الحرارية وقم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني كما هو موضح في المخطوطة. الآن خلط حل حبة مغناطيسية تجارية عن طريق دوامة.
وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. انقل عينة G D N A الموسومة أو المفهرسة إلى عينة جديدة أنبوب سعة خمسة ملليلتر وأضف 0.6 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لكل ميكرولتر من الحجم النهائي لعينة G D N A. امزج المكونات برفق عن طريق السحب واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ضع أنابيب العينة على رف مغناطيسي لمدة دقيقتين حتى يتم مسح المادة الطافية. تخلص من المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخرز. ثم أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ دون خلط.
احتضان لمدة 30 ثانية حتى يمسح eluit وإزالة الطاف بعناية دون إزعاج الخرز. كرر هذا الإجراء وجفف الخرز في الهواء لمدة 10 دقائق. أضف الآن 15 ميكرولترا من 10 ملليمولار تريس عازلة إلى الخرز الممزوج بلطف عن طريق السحب واحتضانه لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
ضع أنابيب العينة على الرف المغناطيسي لمدة دقيقتين للسماح للطافي بالمسح. بعد ذلك ، انقل بعناية 14 ميكرولترا من المادة الطافية من أنبوب العينة إلى أنبوب جديد سعة 0.2 ملليلتر واحصل على المكتبة التي تم تنظيفها. قم بإذابة خرطوشة الكاشف باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
اسحب خمسة ميكرولتر من المكتبة الطبيعية إلى أنبوب منخفض ، 1.5 ملليلتر وقم بتخفيف المكتبة المجمعة عند أربعة نانومولار بالحجم المناسب من RSB. ثم أضف خمسة ميكرولتر لكل من المكتبة المجمعة و 0.2 هيدروكسيد الصوديوم العادي في رابط منخفض جديد ، أنبوب 1.5 ملليلتر. لتشويه المكتبة المجمعة إلى خيوط فردية ، امزج الأنبوب عن طريق الدوامة.
تدور لمدة دقيقة واحدة واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف الآن 10 ميكرولتر من المكتبة المجمعة المشوهة 990 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين المبرد مسبقا واخلطها برفق عن طريق سحب العينات. ضع الأنبوب على الثلج حتى يتم إجراء التخفيف النهائي لتحميل جهاز التسلسل.
صب وإعداد مكتبة تحكم بتركيز أربعة نانومولار عن طريق خلط اثنين ميكرولتر من مكتبة التحكم وثلاثة ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. ثم أضف خمسة ميكرولتر لكل من مكتبة التحكم وأعدت طازجة 0.2 هيدروكسيد الصوديوم العادي. تحويل مكتبة التحكم إلى خيوط مفردة كما هو موضح سابقا.
امزج برفق 10 ميكرولتر من مكتبة التحكم المشوهة و 990 ميكرولتر من مخزن التهجين المبرد مسبقا عن طريق السحب ، وضعه على الثلج حتى يتم التخفيف النهائي لتحميل جهاز التسلسل. في ربط منخفض جديد ، أنبوب 1.5 ملليلتر ، اجمع 594 ميكرولتر من المكتبة المجمعة المشوهة وستة ميكرولتر من مكتبة التحكم المشوهة. امزج بشكل صحيح وقم بتخفيف مزيج المكتبة النهائي إلى تركيز تحميل نهائي يبلغ 1.2 بيكو مولار بحجم 600 ميكرولتر باستخدام مخزن التهجين المبرد مسبقا.
قبل تحميل مزيج المكتبة النهائي على خرطوشة الكاشف ، قم بإجراء معالجة حرارية إضافية لتحقيق تحميل فعال في خلية التدفق. احتضان مزيج المكتبة النهائي لمدة دقيقتين عند 96 درجة مئوية. اقلب الأنبوب لخلطه وضع الأنبوب على الثلج لمدة خمس دقائق.
قم بتحميل 500 ميكرولتر من مزيج المكتبة النهائي في خزان التصميم على خرطوشة الكاشف. بعد بدء جهاز التسلسل ، قم بتحميل خرطوشة الكاشف وخلية التدفق وإعداد تشغيل التسلسل. لتحليل البيانات ، اتصل بخادم بيانات التسلسل وقم بتنزيل ملفات FASTQ.
قم بتقييم الجودة الأولية لبيانات التسلسل الأولية باستخدام برنامج تابع لجهة خارجية. قم بإزالة تسلسلات المحول المتبقية والقواعد منخفضة الجودة والقراءات القصيرة من بيانات التسلسل الأولية. قم بتجميع بيانات تسلسل فحص الجودة في مستوى contig أو سقالة باستخدام برنامج تابع لجهة خارجية.
قم بإجراء تعليق توضيحي للجينوم عن طريق إرسال ملف Phaster الذي يحتوي على الجينوم المجمع إلى خادم RAST. قم بتحميل ملف Phaster إلى مركز علم الأوبئة الجينوم ومنصات الويب لكتابة كليرمونت لتحديد السمات الوبائية. ARGS ، VAGS والبلازميدات.
قم بتحميل ملف Phaster إلى خادم Phaster لتحديد تسلسلات البروفاج. كشف شرح الجينوم عن 5،633 سمة مشفرة منها 5،524 جينات طلاء البروتين و 109 تسلسلات مرتبطة بالحمض النووي الريبي. تنتمي سلالة الإشريكية القولونية المتوقعة إلى مجموعة فيلو B الأولى ونوع التسلسل 40.
تم تحديد محدد لمقاومة مضادات الميكروبات ، وهو ترميز جين M D F A لمضخة تدفق متعددة الأدوية واسعة الطيف. كما تم تحديد الجينات المشفرة للسموم المعوية المستقرة للحرارة وبروتين مقاومة المصل ونظام الإفراز من النوع الثالث جنبا إلى جنب مع بروتينات المستجيب المفرز. يتم تجميع تسلسلات الترميز في مجموعات من البروتينات ذات الصلة وظيفيا تسمى الأنظمة الفرعية خاصة تلك التي تلعب أدوارا وظيفية في الكربوهيدرات والبروتينات والأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي المشتق ونقل الغشاء.
الممارسة المعملية الجيدة أساسية من خلال جميع البروتوكولات. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر بشكل خاص عند معالجة عينات متعددة أثناء إعداد مكتبة الحمض النووي المقطعية لتجنب التلوث المتبادل.
