O sequenciamento completo do genoma, WGS, pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo resistente a antimicrobianos por meio da interrogação do genoma e da identificação de mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo de resistência antimicrobiana. O sequenciamento do genoma mundial melhora a exploração do DNA, DNA bacteriano em larga escala, facilitando a caracterização em profundidade de micróbios em uma única execução, incluindo variantes patogênicas intimamente relacionadas. O sequenciamento de próxima geração fornece rápida identificação e caracterização de microrganismos e seu perfil resistente a antimicrobianos, considerando uma ferramenta para diagnóstico, tratamento, vigilância e rastreamento de fontes de patógenos no contexto clínico.
As metodologias de sequenciamento de próxima geração podem desempenhar um papel determinante na vigilância e no rastreamento de fontes de patógenos, não apenas no contexto clínico, mas também nos ambientes ambientais e, mais importante, na segurança alimentar. Atualmente, essa não é uma técnica rotineira. De fato, um pouco do procedimento tornará mais fácil entender o quão bem sucedido eles realizam o experimento.
Demonstrando o procedimento estará Julissa Enciso-Ibarra, a técnica de genômica do nosso grupo de trabalho. Após a extração e quantificação do DNA bacteriano, adicione 2,5 microlitros de tampão de marcação. Dois microlitros de entrada G D N A em um tubo de 0,2 mililitro e misturar por pipetagem.
Adicione um microlitro de tampão de amplificação e pipeta para cima e para baixo para misturar. Em seguida, gire o tubo para baixo a 280 G por um minuto. Coloque as amostras em um termociclador a 55 graus Celsius por cinco minutos, seguido de segurar a 10 graus Celsius.
Adicione um microlitro de tampão neutralizante aos tubos de amostra e misture suavemente por pipetagem. Gire o tubo e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 1,7 microlitros de cada adaptador de índice e três microlitros de indexação PCR master mix.
Depois de misturar os componentes, gire a 280 G por um minuto à temperatura ambiente. Coloque as amostras no termociclador e realize uma segunda reação de PCR, conforme descrito no manuscrito. Agora misture a solução comercial de grânulos magnéticos por vórtice.
De acordo com as diretrizes do fabricante. Transfira a amostra G D N A marcada ou indexada para um novo tubo de cinco mililitros e adicione 0,6 microlitros de esferas magnéticas para cada microlitro do volume final da amostra G D N A. Misture os componentes suavemente por pipetagem e incube por cinco minutos à temperatura ambiente.
Coloque os tubos de amostra em um rack magnético por dois minutos até que o sobrenadante tenha sido limpo. Descarte o sobrenadante com cuidado sem perturbar as contas. Em seguida, adicione 200 microlitros de etanol a 80% preparado na hora sem misturar.
Incubar durante 30 segundos até que o eluit desapareça e remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as contas. Repita este procedimento e seque as contas ao ar livre por 10 minutos. Agora adicione 15 microlitros de tampão tris de 10 milimolares às contas misturadas suavemente por pipetagem e incube por dois minutos à temperatura ambiente.
Coloque os tubos de amostra no rack magnético por dois minutos, permitindo que o sobrenadante se dissipe. Depois, transfira cuidadosamente 14 microlitros do sobrenadante do tubo de amostra para um novo tubo de 0,2 mililitro e obtenha a biblioteca limpa. Descongele o cartucho reagente seguindo as instruções do fabricante.
Puxe cinco microlitros da biblioteca normalizada para um tubo de 1,5 mililitro de baixa ligação e dilua a biblioteca agrupada em quatro nanomolares com o volume adequado de RSB. Em seguida, adicione cinco microlitros cada um da biblioteca agrupada e 0,2 hidróxido de sódio normal em um novo tubo de 1,5 mililitro de ligação baixa. Para desnaturar a biblioteca agrupada em fios simples, misture o tubo por vórtice.
Gire por um minuto e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Agora adicione 10 microlitros da biblioteca agrupada desnaturada 990 microlitros de tampão de hibridização pré-resfriado e misture suavemente por pipetagem. Coloque o tubo sobre gelo até que seja realizada a diluição final para o carregamento do sequenciador.
Despeje e prepare uma biblioteca de controle a uma concentração de quatro nanomolares misturando dois microlitros da biblioteca de controle e três microlitros de água livre de nuclease. Em seguida, adicione cinco microlitros cada um da biblioteca de controle e recém-preparado 0,2 hidróxido de sódio normal. Desnature a biblioteca de controle em cadeias únicas, como demonstrado anteriormente.
Misture suavemente 10 microlitros de biblioteca de controle desnaturada e 990 microlitros de tampão de hibridização pré-resfriado por pipetagem e coloque-o no gelo até que a diluição final para o carregamento do sequenciador seja feita. Em um novo tubo de 1,5 mililitro de ligação baixa, combine 594 microlitros da biblioteca agrupada desnaturada e seis microlitros da biblioteca de controle desnaturada. Misturar adequadamente e diluir a mistura final da biblioteca para uma concentração de carga final de 1,2 peco molar em um volume de 600 microlitros usando o tampão de hibridização pré-resfriado.
Antes de carregar a mistura final da biblioteca no cartucho reagente, execute um pré-tratamento térmico adicional para obter uma carga eficiente na célula de fluxo. Incube a mistura final da biblioteca por dois minutos a 96 graus Celsius. Inverta o tubo para misturar e coloque o tubo no gelo por cinco minutos.
Carregue 500 microlitros da mistura da biblioteca final no reservatório de projeto no cartucho do reagente. Depois de iniciar o sequenciador, carregue o cartucho do reagente, a célula de fluxo e configure a execução do sequenciamento. Para análise de dados, conecte-se ao servidor de dados de sequenciamento e baixe os arquivos FASTQ.
Avalie a qualidade inicial dos dados de sequência bruta com software de terceiros. Remova sequências de adaptadores remanescentes, bases de baixa qualidade e leituras curtas dos dados brutos de sequenciamento. Monte os dados de sequenciamento de verificação de qualidade em nível de contig ou andaime usando software de terceiros.
Execute a anotação do genoma enviando o arquivo Phaster contendo o genoma montado para o servidor RAST. Carregue o arquivo Phaster para o Centro de Epidemiologia do Genoma e as plataformas web de digitação Claremont para identificar características epidemiológicas. ARGS, VAGS e plasmídeos.
Carregue o arquivo Phaster no servidor Phaster para identificar sequências de prófagos. A anotação do genoma revelou 5.633 características codificadas, das quais 5.524 são genes de revestimento de proteínas e 109 são sequências relacionadas ao RNA. A cepa prevista de Escherichia coli pertence ao filo do grupo B um e do tipo de sequência 40.
Um determinante da resistência antimicrobiana, o gene M D F A que codifica uma bomba de efluxo multifármaco de amplo espectro, foi identificado. Genes que codificam para uma enterotoxina estável ao calor, uma proteína de resistência sérica e o sistema de secreção tipo três, juntamente com suas proteínas efetoras secretadas, também foram identificados. As sequências de codificação são agrupadas em coleções de proteínas funcionalmente relacionadas chamadas subsistemas, especialmente aquelas que desempenham papéis funcionais em carboidratos, proteínas, aminoácidos e metabolismos derivados e transporte de membranas.
Boas práticas de laboratório são fundamentais em todo o protocolo. No entanto, um cuidado especial deve ser tomado ao processar várias amostras durante a preparação da biblioteca de DNA seccional para evitar a contaminação cruzada.
