Tüm genom dizilimi, WGS, genom sorgulaması ve antimikrobiyal direnç fenotipinin altında yatan moleküler mekanizmaların tanımlanması yoluyla antimikrobiyal dirençli alandaki kilit soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Dünya genom dizilimi, DNA'nın, bakteri DNA'sının büyük ölçekte araştırılmasını geliştirir ve yakından ilişkili patojenik varyantlar da dahil olmak üzere mikropların tek bir çalışmada derinlemesine karakterizasyonunu kolaylaştırır. Yeni nesil dizileme, klinik bağlamda patojenlerin tanı, tedavi, sürveyans ve kaynak takibi için bir araç göz önünde bulundurularak mikroorganizmaların ve antimikrobiyal dirençli profillerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasını ve karakterizasyonunu sağlar.
Yeni nesil dizileme metodolojileri, patojenlerin sadece klinik bağlamda değil, aynı zamanda çevresel ortamlarda ve daha da önemlisi gıda güvenliğinde sürveyans ve kaynak takibinde belirleyici bir rol oynayabilir. Şu anda, bu rutin bir teknik değildir. Gerçekten de, prosedürün bir kısmı, deneyi ne kadar başarılı bir şekilde gerçekleştirdiklerini anlamayı kolaylaştıracaktır.
Prosedürü gösteren, çalışma grubumuzun genomik teknisyeni Julissa Enciso-Ibarra olacaktır. Bakteri DNA'sı çıkarıldıktan ve ölçüldükten sonra 2.5 mikrolitre etiketleme tamponu ekleyin. 0,2 mililitrelik bir tüpte iki mikrolitre G D N A girişi ve pipetleme ile karıştırılır.
Karıştırmak için bir mikrolitre amplifikasyon tamponu ve pipeti yukarı ve aşağı ekleyin. Ardından tüpü bir dakika boyunca 280 G'de döndürün. Numuneleri beş dakika boyunca 55 santigrat derecede bir termosikler içine yerleştirin, ardından 10 santigrat derecede tutun.
Numune tüplerine bir mikrolitre nötralize edici tampon ekleyin ve pipetleyerek, yavaşça karıştırın. Tüpü aşağı doğru döndürün ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, her bir indeks adaptöründen 1,7 mikrolitre ve üç mikrolitre indeksleme PCR ana karışımı ekleyin.
Bileşenleri karıştırdıktan sonra, oda sıcaklığında bir dakika boyunca 280 G'de aşağı doğru döndürün. Numuneleri termosikler içine yerleştirin ve makalede açıklandığı gibi ikinci bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin. Şimdi ticari manyetik boncuk çözeltisini vorteks yaparak karıştırın.
Üreticinin yönergelerine göre. Etiketlenmiş veya indekslenmiş G D N A örneğini yeni bir beş mililitrelik tüpe aktarın ve G D N A numunesinin son hacminin her mikrolitresi için 0,6 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin. Bileşenleri pipetleyerek nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.
Numune tüplerini, süpernatant temizlenene kadar iki dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın. Daha sonra karıştırmadan 200 mikrolitre taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin.
Eluit temizlenene kadar 30 saniye boyunca inkübe edin ve boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın. Bu prosedürü tekrarlayın ve boncukları 10 dakika boyunca hava ile kurulayın. Şimdi pipetle pipetlenerek hafifçe karıştırılan boncuklara 15 mikrolitre 10 milimolar tris tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın.
Numune tüplerini manyetik rafa iki dakika boyunca yerleştirin ve süpernatantın temizlenmesini sağlayın. Daha sonra, süpernatantın 14 mikrolitresini numune tüpünden yeni bir 0.2 mililitrelik tüpe dikkatlice aktarın ve kütüphaneyi temizleyin. Reaktif kartuşunu üreticinin talimatlarını izleyerek çözün.
Normalleştirilmiş kütüphanenin beş mikrolitresini düşük bağlanmalı, 1.5 mililitrelik bir tüpe çekin ve havuzlanmış kütüphaneyi uygun RSB hacmiyle dört nanomolar arasında seyreltin. Ardından, havuzlanmış kütüphanenin her birine beş mikrolitre ve yeni bir düşük bağlanmalı, 1.5 mililitrelik tüpe 0.2 normal sodyum hidroksit ekleyin. Havuzlanmış kütüphaneyi tek iplikçiklere denatüre etmek için, tüpü vorteks yaparak karıştırın.
Bir dakika boyunca döndürün ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Şimdi denatüre edilmiş havuzlanmış kütüphanenin 10 mikrolitresini 990 mikrolitre önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponu ekleyin ve pipetleme ile nazikçe karıştırın. Sıralayıcı yüklemesi için son seyreltme yapılana kadar tüpü buz üzerine yerleştirin.
Kontrol kütüphanesinin iki mikrolitresini ve üç mikrolitre nükleaz içermeyen suyu karıştırarak dört nanomolar konsantrasyonda bir kontrol kütüphanesi dökün ve hazırlayın. Daha sonra kontrol kütüphanesinin her birine beş mikrolitre ve taze hazırlanmış 0.2 normal sodyum hidroksit ekleyin. Kontrol kütüphanesini daha önce gösterildiği gibi tek iplikçiklere denatüre edin.
10 mikrolitre denatüre kontrol kütüphanesi ve 990 mikrolitre önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponunu pipetleme ile yavaşça karıştırın ve sıralayıcı yüklemesi için son seyreltme yapılana kadar buz üzerine yerleştirin. Yeni bir düşük bağlamada, 1.5 mililitrelik tüp, denatüre havuzlanmış kütüphanenin 594 mikrolitresini ve denatüre kontrol kütüphanesinin altı mikrolitresini birleştirir. Düzgün bir şekilde karıştırın ve önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponunu kullanarak son kütüphane karışımını 600 mikrolitrelik bir hacimde 1.2 peko molar son yükleme konsantrasyonuna seyreltin.
Son kütüphane karışımını reaktif kartuşuna yüklemeden önce, akış hücresine verimli yükleme sağlamak için ek bir termal ön işlem gerçekleştirin. Son kütüphane karışımını iki dakika boyunca 96 santigrat derecede inkübe edin. Tüpü karıştırmak ve beş dakika boyunca buz üzerine yerleştirmek için tüpü ters çevirin.
Son kütüphane karışımının 500 mikrolitresini reaktif kartuşundaki tasarım haznesine yükleyin. Sıralayıcıyı başlattıktan sonra reaktif kartuşunu, akış hücresini yükleyin ve sıralama çalışmasını ayarlayın. Veri analizi için, sıralama veri sunucusuna bağlanın ve FASTQ dosyalarını indirin.
Üçüncü taraf yazılımlarla ham dizi verilerinin başlangıç kalitesini değerlendirin. Kalan bağdaştırıcı dizilerini, düşük kaliteli tabanları ve kısa okumaları ham sıralama verilerinden kaldırın. Kalite kontrol sıralama verilerini üçüncü taraf yazılımı kullanarak contig veya iskele seviyesine monte edin.
Toplanan genomu içeren Phaster dosyasını RAST sunucusuna göndererek genom ek açıklaması gerçekleştirin. Epidemiyolojik özellikleri tanımlamak için Phaster dosyasını Genom Epidemiyolojisi Merkezi ve Claremont yazma web platformlarına yükleyin. ARGS, VAGS ve plazmidler.
Profaj dizilerini tanımlamak için Phaster dosyasını Phaster sunucusuna yükleyin. Genom ek açıklaması, 5.524'ü protein kaplama genleri ve 109'u RNA ile ilişkili diziler olan 5.633 kodlanmış özelliği ortaya çıkardı. Tahmin edilen Escherichia coli suşu filo B grubu bir ve sekans tipi 40'a aittir.
Bir antimikrobiyal direnç belirleyicisi olan M D F A genini kodlayan geniş spektrumlu çoklu ilaç efflux pompası tanımlanmıştır. Isıya dayanıklı enterotoksin için kodlayan genler, bir serum direnç proteini ve salgılanan efektör proteinleri ile birlikte tip üç sekresyon sistemi de tanımlandı. Kodlama dizileri, özellikle karbonhidratlarda, proteinlerde, amino asitlerde ve türev metabolizmalarda ve membran taşınmasında fonksiyonel rol oynayan alt sistemler olarak adlandırılan fonksiyonel olarak ilişkili proteinlerin koleksiyonları halinde gruplandırılır.
İyi laboratuvar uygulamaları tüm protokol boyunca esastır. Bununla birlikte, çapraz kontaminasyonu önlemek için kesitsel DNA kütüphanesi hazırlığı sırasında birden fazla numune işlenirken özel bir özen gösterilmelidir.
