Die Gesamtgenomsequenzierung, WGS, kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der antimikrobiellen Resistenz durch Genomabfrage und die Identifizierung molekularer Mechanismen, die dem antimikrobiellen Resistenzphänotyp zugrunde liegen, zu beantworten. Die Weltgenomsequenzierung verbessert die Erforschung von DNA, bakterieller DNA in großem Maßstab und erleichtert die eingehende Charakterisierung von Mikroben in einem einzigen Durchlauf, einschließlich eng verwandter pathogener Varianten. Next Generation Sequencing ermöglicht eine schnelle Identifizierung und Charakterisierung von Mikroorganismen und ihrem antimikrobiellen Resistenzprofil als Instrument für Diagnose, Behandlung, Überwachung und Quellenverfolgung von Krankheitserregern im klinischen Kontext.
Next-Generation-Sequenzierungsmethoden können eine entscheidende Rolle bei der Überwachung und Quellenverfolgung von Krankheitserregern spielen, nicht nur im klinischen Kontext, sondern auch im Umweltumfeld und vor allem in der Lebensmittelsicherheit. Derzeit ist dies keine Routinetechnik. In der Tat wird ein Teil des Verfahrens es einfacher machen zu verstehen, wie erfolgreich sie das Experiment durchführen.
Julissa Enciso-Ibarra, Genomik-Technikerin unserer Arbeitsgruppe, demonstriert das Verfahren. Nach der Extraktion und Quantifizierung bakterieller DNA fügen Sie 2,5 Mikroliter Tagmentationspuffer hinzu. Zwei Mikroliter Input GD N A in einem 0,2 Milliliter Röhrchen und mischen durch Pipettieren.
Fügen Sie einen Mikroliter Amplifikationspuffer hinzu und pipetten Sie zum Mischen auf und ab. Dann drehen Sie die Röhre bei 280 G für eine Minute herunter. Legen Sie die Proben für fünf Minuten in einen Thermocycler bei 55 Grad Celsius, gefolgt von einem Halten bei 10 Grad Celsius.
Fügen Sie einen Mikroliter neutralisierenden Puffer in die Probenröhrchen und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Drehen Sie das Röhrchen herunter und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes fügen Sie 1,7 Mikroliter jedes Indexadapters und drei Mikroliter Indexierungs-PCR-Mastermix hinzu.
Nach dem Mischen der Komponenten bei 280 G für eine Minute bei Raumtemperatur herunterdrehen. Legen Sie die Proben in den Thermocycler und führen Sie eine zweite PCR-Reaktion durch, wie im Manuskript beschrieben. Mischen Sie nun die handelsübliche magnetische Perlenlösung durch Vortexen.
Gemäß den Richtlinien des Herstellers. Die getaggte oder indizierte G D N A-Probe wird in ein neues Fünf-Milliliter-Röhrchen überführt und 0,6 Mikroliter magnetische Kügelchen für jeden Mikroliter des Endvolumens der G D N A-Probe hinzugefügt. Mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Legen Sie die Probenröhrchen zwei Minuten lang auf ein Magnetgestell, bis der Überstand verschwunden ist. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig, ohne die Perlen zu stören. Dann fügen Sie 200 Mikroliter frisch zubereitetes 80% Ethanol ohne Mischen hinzu.
Inkubieren Sie für 30 Sekunden, bis sich der Eluit klärt, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören. Wiederholen Sie diesen Vorgang und trocknen Sie die Perlen 10 Minuten lang an der Luft. Fügen Sie nun 15 Mikroliter 10 Millimolar Tris-Puffer zu den Perlen hinzu, die vorsichtig durch Pipettieren gemischt werden, und inkubieren Sie zwei Minuten bei Raumtemperatur.
Legen Sie die Probenröhrchen zwei Minuten lang auf das Magnetgestell, damit sich der Überstand klären kann. Anschließend werden vorsichtig 14 Mikroliter des Überstands aus dem Probenröhrchen in ein neues 0,2-Milliliter-Röhrchen überführt und die gereinigte Bibliothek erstellt. Tauen Sie die Reagenzienpatrone gemäß den Anweisungen des Herstellers auf.
Ziehen Sie fünf Mikroliter der normalisierten Bibliothek in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit niedriger Bindung und verdünnen Sie die gepoolte Bibliothek bei vier Nanomolaren mit dem richtigen Volumen von RSB. Fügen Sie dann jeweils fünf Mikroliter der gepoolten Bibliothek und 0,2 normales Natriumhydroxid in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen mit niedriger Bindung hinzu. Um die gepoolte Bibliothek in einzelne Stränge zu denaturieren, mischen Sie die Röhre durch Wirbeln.
Eine Minute herunterdrehen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie nun 10 Mikroliter der denaturierten gepoolten Bibliothek 990 Mikroliter vorgekühlten Hybridisierungspuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis, bis die endgültige Verdünnung für das Laden des Sequenzers durchgeführt wurde.
Gießen und bereiten Sie eine Kontrollbibliothek in einer Konzentration von vier Nanomolaren vor, indem Sie zwei Mikroliter der Kontrollbibliothek und drei Mikroliter nukleasefreies Wasser mischen. Dann fügen Sie jeweils fünf Mikroliter der Steuerungsbibliothek und frisch zubereitete 0,2 normale Natronlauge hinzu. Denaturieren Sie die Steuerungsbibliothek in einzelne Stränge, wie zuvor gezeigt.
Mischen Sie vorsichtig 10 Mikroliter denaturierte Kontrollbibliothek und 990 Mikroliter vorgekühlten Hybridisierungspuffer durch Pipettieren und legen Sie es auf Eis, bis die endgültige Verdünnung für die Sequenzerbeladung abgeschlossen ist. In einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen mit niedriger Bindebinde werden 594 Mikroliter der denaturierten Poolbibliothek und sechs Mikroliter der denaturierten Kontrollbibliothek kombiniert. Mischen Sie richtig und verdünnen Sie die endgültige Bibliotheksmischung auf eine endgültige Beladungskonzentration von 1,2 Peco Molar in einem Volumen von 600 Mikrolitern unter Verwendung des vorgekühlten Hybridisierungspuffers.
Bevor Sie die endgültige Bibliotheksmischung auf die Reagenzienkartusche laden, führen Sie eine zusätzliche thermische Vorbehandlung durch, um eine effiziente Beladung in die Durchflusszelle zu erreichen. Inkubieren Sie die endgültige Bibliotheksmischung für zwei Minuten bei 96 Grad Celsius. Drehen Sie das Röhrchen um, um es zu mischen und legen Sie es fünf Minuten lang auf Eis.
Laden Sie 500 Mikroliter der endgültigen Bibliotheksmischung in das Designreservoir der Reagenzienpatrone. Nach dem Initiieren des Sequenzers laden Sie die Reagenzienkartusche, die Durchflusszelle und richten den Sequenzierlauf ein. Stellen Sie für die Datenanalyse eine Verbindung zum Sequenzdatenserver her und laden Sie die FASTQ-Dateien herunter.
Bewerten Sie die anfängliche Qualität von Rohsequenzdaten mit Software von Drittanbietern. Entfernen Sie Restadaptersequenzen, Basen mit geringer Qualität und kurze Lesevorgänge aus den Rohsequenzierungsdaten. Stellen Sie die Sequenzierungsdaten der Qualitätsprüfung mithilfe von Software von Drittanbietern auf Kontigierungs- oder Gerüstebene zusammen.
Führen Sie eine Genomannotation durch, indem Sie die Pister-Datei mit dem assemblierten Genom an den RAST-Server senden. Laden Sie die Phaster-Datei auf die Webplattformen Center for Genome Epidemiology und Claremont hoch, um epidemiologische Merkmale zu identifizieren. ARGS, VAGS und Plasmide.
Laden Sie die Pister-Datei auf den Pister-Server hoch, um Prophage-Sequenzen zu identifizieren. Die Genomannotation ergab 5.633 kodierte Merkmale, von denen 5.524 Proteinbeschichtungsgene und 109 RNA-verwandte Sequenzen sind. Der vorhergesagte Escherichia coli-Stamm gehört zur Filogruppe B eins und zum Sequenztyp 40.
Eine antimikrobielle Resistenzdeterminante, das M D F A-Gen, das für eine Breitband-Multi-Drug-Effluxpumpe kodiert, wurde identifiziert. Gene, die für ein hitzestabiles Enterotoxin kodieren, ein Serumresistenzprotein und das Typ-Drei-Sekretionssystem zusammen mit seinen sezernierten Effektorproteinen wurden ebenfalls identifiziert. Die kodierenden Sequenzen werden in Sammlungen funktionell verwandter Proteine gruppiert, die als Subsysteme bezeichnet werden, insbesondere solche, die funktionelle Rollen in Kohlenhydraten, Proteinen, Aminosäuren und Derivatstoffwechsel und Membrantransport spielen.
Gute Laborpraxis ist durch das gesamte Protokoll von grundlegender Bedeutung. Bei der Verarbeitung mehrerer Proben während der Vorbereitung der DNA-Schnittbibliothek ist jedoch besondere Vorsicht geboten, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
