全ゲノムシーケンシング(WGS)は、ゲノム調査と抗菌薬耐性表現型の根底にある分子メカニズムの特定を通じて、抗菌薬耐性分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。ワールドゲノムシーケンシングは、DNA、細菌DNAの大規模な探索を改善し、密接に関連する病原性多様体を含む微生物の詳細な特性評価を1回の実行で容易にします。次世代シーケンシングは、臨床現場での病原体の診断、治療、監視、および発生源追跡のためのツールを考慮して、微生物とその抗菌薬耐性プロファイルの迅速な同定と特性評価を提供します。
次世代シーケンシング方法論は、臨床環境だけでなく、環境環境、そして重要な食品の安全性においても、病原体の監視と発生源追跡において決定的な役割を果たすことができます。現在、これは日常的な手法ではありません。確かに、手順の少しはすべて、彼らが実験をどれほど成功させたかを理解しやすくするでしょう。
手順を実演するのは、私たちのワーキンググループのゲノミクス技術者であるジュリッサエンシソイバラです。細菌DNAを抽出および定量した後、2.5マイクロリットルのタグメンテーションバッファーを追加します。0.2ミリリットルのチューブに2マイクロリットルの投入G D N Aを入れ、ピペッティングにより混合する。
1マイクロリットルの増幅バッファーを加え、ピペットを上下に動かして混合します。次に、チューブを280Gで1分間回転させます。サンプルを摂氏55度のサーモサイクラーに5分間入れ、続いて摂氏10度で保持します。
1マイクロリットルの中和バッファーをサンプルチューブに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。チューブをスピンダウンし、室温で5分間インキュベートします。次に、各インデックスアダプター1.7マイクロリットルとインデックスPCRマスターミックス3マイクロリットルを追加します。
成分を混合した後、室温で1分間280Gでスピンダウンする。サンプルをサーモサイクラーに入れ、原稿に記載されているように2回目のPCR反応を行います。次に、市販の磁気ビーズ溶液をボルテックスで混合します。
メーカーのガイドラインに従って。タグ付きまたはインデックス付きG D N Aサンプルを新しいものに移し、G D N Aサンプルの最終容量の各マイクロリットルに0.6マイクロリットルの磁気ビーズを追加します。ピペッティングで成分を穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。
上清がなくなるまで、サンプルチューブを磁気ラックに2分間置きます。ビーズを乱さずに上清を慎重に廃棄してください。次に、混合せずに200マイクロリットルの新しく調製した80%エタノールを追加します。
溶出液が透明になるまで30秒間インキュベートし、ビーズを乱さずに上清を慎重に取り除きます。この手順を繰り返し、ビーズを10分間風乾します。次に、ピペッティングで穏やかに混合したビーズに15マイクロリットルの10ミリモルトリスバッファーを加え、室温で2分間インキュベートします。
サンプルチューブを磁気ラックに2分間置き、上清が透明になるまで待ちます。その後、14マイクロリットルの上清をサンプルチューブから新しい0.2ミリリットルのチューブに慎重に移し、クリーンアップしたライブラリを入手します。製造元の指示に従って試薬カートリッジを解凍します。
正規化されたライブラリの5マイクロリットルを低結合の1.5ミリリットルのチューブに引き込み、プールされたライブラリを適切な量のRSBで4ナノモルに希釈します。次に、プールされたライブラリと0.2ノルマル水酸化ナトリウムをそれぞれ5マイクロリットルずつ、新しい低結合の1.5ミリリットルチューブに追加します。プールされたライブラリをシングルストランドに変性させるには、ボルテックスによってチューブを混合します。
1分間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートします。次に、10マイクロリットルの変性プールライブラリー990マイクロリットルのプレチルドハイブリダイゼーションバッファーを加え、ピペッティングにより穏やかに混合する。シーケンサーローディングの最終希釈が行われるまで、チューブを氷上に置きます。
2マイクロリットルのコントロールライブラリと3マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水を混合することにより、4ナノモルの濃度でコントロールライブラリを注ぎ、調製します。次に、コントロールライブラリと新たに調製した0.2ノルマル水酸化ナトリウムをそれぞれ5マイクロリットル加えます。前述のように、コントロールライブラリを一本鎖に変性させます。
10マイクロリットルの変性コントロールライブラリーと990マイクロリットルのプレチルドハイブリダイゼーションバッファーをピペッティングで穏やかに混合し、シーケンサーローディングの最終希釈が完了するまで氷上に置きます。新しい低結合の1.5ミリリットルチューブで、594マイクロリットルの変性プールライブラリと6マイクロリットルの変性コントロールライブラリを組み合わせます。適切に混合し、プレチルドハイブリダイゼーションバッファーを使用して、最終ライブラリーミックスを600マイクロリットルの容量で1.2ペコモルの最終負荷濃度に希釈します。
最終的なライブラリミックスを試薬カートリッジにロードする前に、追加の熱前処理を実行して、フローセルへの効率的なロードを実現します。最終的なライブラリミックスを摂氏96度で2分間インキュベートします。チューブを反転させて混合し、チューブを氷の上に5分間置きます。
500マイクロリットルの最終ライブラリミックスを試薬カートリッジの設計リザーバーにロードします。シーケンサーを開始した後、試薬カートリッジをロードし、フローセル、シーケンシングランをセットアップした。データ解析のために、シーケンシングデータサーバーに接続し、FASTQファイルをダウンロードします。
生のシーケンスデータの初期品質をサードパーティのソフトウェアで評価します。未加工のシーケンスデータからレムナントアダプターシーケンス、低品質の塩基、およびショートリードを削除します。サードパーティのソフトウェアを使用して、品質チェックシーケンスデータをコンティグレベルまたはスキャフォールディングレベルにアセンブルします。
アセンブルされたゲノムを含むPhasterファイルをRASTサーバーに送信することにより、ゲノムアノテーションを実行します。Phasterファイルをゲノム疫学センターとクレアモントタイピングWebプラットフォームにアップロードして、疫学的特徴を特定します。ARGS、VAGSおよびプラスミド。
PhasterファイルをPhasterサーバーにアップロードして、プロファージシーケンスを特定します。ゲノムアノテーションは、5, 633のコードされた特徴を明らかにし、そのうち5, 524はタンパク質コーティング遺伝子であり、109はRNA関連配列である。予測された大腸菌株は、フィログループB1および配列タイプ40に属する。
抗菌剤耐性決定基であるMDFをコードする遺伝子を広域スペクトル多剤排出ポンプに同定した。また、熱安定エンテロトキシンである血清耐性タンパク質および3型分泌系をコードする遺伝子とその分泌エフェクタータンパク質も同定された。コード配列は、サブシステムと呼ばれる機能的に関連するタンパク質のコレクション、特に炭水化物、タンパク質、アミノ酸、誘導体代謝および膜輸送において機能的役割を果たすものにグループ化されます。
優れたラボプラクティスは、すべてのプロトコルを通じて基本です。ただし、断面DNAライブラリの調製中に複数のサンプルを処理する場合は、交差汚染を避けるために特別な注意を払う必要があります。
