Этот протокол важен, потому что он позволяет изучать функцию стволовых клеток в различных скелетных мышцах, углубляя наше понимание того, как они способствуют гомеостазу, регенерации и прогрессированию заболевания. Используя этот протокол, мы можем выделить две популяции живых стволовых клеток из определенных мышц и изучить, как они работают. Чтобы начать мышечную изоляцию, опрыскайте усыпленную мышь этанолом и поместите ее животом вверх.
С помощью ножниц сделайте горизонтальный разрез длиной 0,5 сантиметра в коже живота. Обеими руками потяните кожу, чтобы обнажить туловище, а также нижние конечности вплоть до задних конечностей. Найдите грацилис или внутреннюю мышцу бедра и, используя пару изогнутых щипцов, возьмитесь за нее и слегка приподнимите мышцу.
С помощью ножниц сделайте разрез в 0,5 сантиметра, чтобы вырезать грацилисную мышцу. Повторите процедуру на другой ноге. С помощью скальпеля разрежьте фасцию, сделав 0,5-сантиметровый разрез вдоль боковой стороны большеберцовой кости.
Затем захватите фасцию с помощью изогнутых щипцов и удалите ее, потянув, обнажив сухожилия на дистальном конце задней конечности. Затем вставьте пару прямых щипцов с очень тонкими наконечниками между дистальным сухожилием ТА и мышцей EDL. Разделите мышцы, сдвинув щипцы к проксимальному концу мышц.
Верните щипцы к дистальному концу и перережьте дистальное сухожилие. Осторожно захватите дистальное сухожилие ТА изогнутыми щипцами и поднимите мышцу вверх и над ее проксимальным прикреплением. Чтобы аккуратно разрезать проксимальное сухожилие, отрежьте другой конец как можно ближе к его прикреплению и перенесите ТА в чашку Петри.
Затем используйте прямые щипцы с очень тонкими наконечниками, чтобы пройти под дистальным сухожилием EDL, и сдвиньте щипцы к проксимальному концу мышцы, чтобы отделить мышцы друг от друга. Верните щипцы к дистальному концу и перережьте дистальное сухожилие, не повреждая мышцу. Осторожно захватив дистальное сухожилие EDL изогнутыми щипцами, поднимите мышцу вверх и над ее проксимальным прикреплением, чтобы аккуратно разрезать проксимальное сухожилие как можно ближе к его прикреплению.
Отрежьте другой конец и перенесите мышцу EDL в чашку Петри. Повторите процедуру для другой задней конечности. Используйте прямые щипцы с очень тонкими наконечниками, чтобы проникнуть между ахилловым сухожилием и нижними костями задних конечностей.
Сдвиньте щипцы к проксимальному концу мышцы, чтобы отделить мышцу от костей. Верните щипцы к дистальному концу и перережьте дистальное сухожилие. Потяните икроножную мышцу или GA вверх и над малоберцовой костью.
Чтобы найти сухожилие проксимального отдела камбаловидной мышцы. Вставьте прямые щипцы между камбаловидной мышцей и мышцами GA и переместите щипцы к дистальному концу мышц, чтобы отделить камбаловидную мышцу от GA. Теперь перережьте проксимальное камбаловидное сухожилие. Захватите его изогнутыми щипцами и осторожно приподнимите су, чтобы получить доступ к его дистальному сухожилию.
Разрежьте дистальное сухожилие, чтобы изолировать камбаловидную мышцу от ГА, и поместите камбаловидную мышцу в чашку Петри, содержащую промывочную среду. Затем нарежьте GA и поместите его в чашку Петри. Чтобы изолировать трехглавую мышцу, используйте прямые щипцы со сверхтонкими наконечниками, чтобы протянуть руку между трицепсом и плечевой костью, и сдвиньте щипцы к проксимальному концу мышцы, чтобы отделить мышцу от кости.
Затем разрежьте дистальный конец трехглавой мышцы и с помощью изогнутых щипцов подтяните ее вверх и над локтем, чтобы получить доступ к проксимальному сухожилию. Перережьте проксимальное сухожилие трицепса и перенесите мышцу в чашку Петри. Повторите процедуру для остальных четырех конечностей.
Чтобы удалить шерсть и кожу с челюсти, с помощью ножниц сделайте разрез на 0,5 сантиметра ниже глаза, разрезая в каудальном направлении. Затем, используя большие и указательные пальцы обеих рук, зажмите каждую сторону разреза и удалите кожу, потянув ее вверх и вниз. Найдите основное сухожилие жевательной мышцы на каудальной стороне под глазом и вставьте плоское лезвие скальпеля между костью и мышцей, чтобы перерезать сухожилие.
Возьмитесь за крупное жевательное сухожилие изогнутыми щипцами и разрежьте его лезвием скальпеля или ножницами в ростральном направлении, чтобы отделить жевательную мышцу от челюстной кости. Поместите изолированную жевательную мышцу в чашку Петри и повторите процедуру для второй жевательной мышцы. С помощью ножниц сделайте торакотомию в середине грудины и прорежьте грудину.
Обнажите диафрагму, разрезав грудную клетку на 360 градусов. Затем, чтобы отделить верхнюю часть тела от живота, используйте ножницы, чтобы разрезать трахею, пищевод, полую вену и брюшную аорту. Затем с помощью ножниц сделайте лапаротомию на сантиметр ниже грудины и сделайте разрез примерно на 360 градусов.
Поместите закрытые ножницы между грудной клеткой и органами брюшной полости и надавите. Аккуратно потяните за грудную клетку, чтобы отделить ее от органов брюшной полости. Чтобы отделить диафрагму от грудной клетки, неплотно зажмите диафрагму между двумя пальцами и прорежьте грудную клетку ножницами.
Обрежьте диафрагму как можно ближе к ребрам примерно на 360 градусов и поместите изолированную диафрагму в чашку Петри. Измельчите изолированные мышцы одну за другой, разрезав их на кусочки размером примерно один миллиметр. Перенесите измельченные мышцы в 15-литровую коническую трубку, содержащую пять литров диссоциативного буфера, и инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 35 минут на встряхивающей водяной бане со скоростью 60 оборотов в минуту.
После ферментативного переваривания измельченных мышц перенесите суспензию из 15-миллилитровой пробирки в 50-миллилитровую. Используя шприц объемом 10 миллилитров, оснащенный иглой 20-го калибра, повторно подвешивайте образец, пять раз протягивая его вверх и вниз через иглу. Наберите клеточную суспензию в шприц и процедите образец в новую коническую трубку объемом 50 миллилитров, оснащенную клеточным ситечком сверху.
Чтобы извлечь все моноядерные клетки, промойте пустую коническую пробирку 20 миллилитрами промывочного средства и вылейте ее через сетчатое фильтро, чтобы соединить с процеженным образцом. Извлеките оставшийся объем под клеточный фильтр с помощью пипетки P1000. После диссоциации тканей и окрашивания антител стволовые клетки скелетных мышц или MuSC и фиброзно-адипогенные предшественники или FAP из отдельных мышц были очищены путем сортировки клеток, активированной флуоресценцией.
После первоначального стробирования для идентификации клеток и отделения синглетов от дублетов последующие ворота были установлены с использованием элементов управления FMO для определения порогов окрашивания. Образец пятна закрывали, а SCA1-положительную CD31-отрицательную и CD45-отрицательную популяцию, соответствующие FAP, сортировали в отдельную пробирку для сбора. Двойная отрицательная популяция была дополнительно закрыта для сортировки VCA-положительной популяции, соответствующей MuSC.
Одноклеточные суспензии мышц диафрагмы и трицепса, в отличие от других, имели более высокое относительное содержание MuSC, чем FAP. Окрашивание EDU, хотя и надежное, показало разницу во фракциях EDU-положительных клеток для двух типов стволовых клеток и в разных мышцах. Однако для всех тканей средняя доля EDU-положительных MuSC была выше, чем у EDU-положительных FAP.
MuSC, выделенные из EDL и GA, показали значительно более низкое включение EDU по сравнению с таковыми из TA, диафрагмы, грацилиса или трицепса. Аналогичным образом, значительные различия в включении EDU также наблюдались в FAP, изолированных из разных мышц. Наконец, чистота клеток была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием, что указывает на специфичность протокола выделения стволовых клеток.
Наиболее важным этапом является механическое переваривание ткани. Когда ткань разрезается слишком сильно, жизнеспособность снижается. Когда ткань разрезается слишком мало, EEL снижается.
Протокол можно комбинировать с анализами, которые измеряют поведение клеток, такими как приживление трансплантата после трансплантации, чтобы лучше понять функции стволовых клеток in vivo. Этот метод может ответить на вопрос, могут ли различия в поведении стволовых клеток в отдельных мышцах способствовать фенотипам заболеваний и заболеваниям, характеризующимся уникальными паттернами пораженных мышц.
