פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר לחקור את תפקוד תאי הגזע על פני שרירי שלד שונים, ולהעמיק את הבנתנו כיצד הם תורמים להומאוסטזיס, התחדשות והתקדמות המחלה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים לבודד שתי אוכלוסיות של תאי גזע חיים משרירים ספציפיים ולחקור כיצד הם פועלים. כדי להתחיל בבידוד שרירים, רססו את העכבר שעבר המתת חסד באתנול והניחו אותו כשהבטן פונה כלפי מעלה.
באמצעות מספריים, לבצע חתך אופקי באורך 0.5 ס"מ לתוך עור הבטן. בעזרת שתי הידיים, משוך את העור כדי לחשוף את פלג הגוף העליון, כמו גם את הגפיים התחתונות עד הגפיים האחוריות. אתרו את שריר הגרציליס או שריר הירך הפנימי ובעזרת זוג מלקחיים מעוקלים אחזו בו והרימו מעט את השריר.
באמצעות מספריים, לבצע חתך 0.5 ס"מ לחתוך את שריר gracilis. חזור על ההליך ברגל השנייה. בעזרת אזמל, חותכים את הפאשיה על ידי ביצוע חתך של 0.5 ס"מ לאורך הצד הצידי של השוקה.
לאחר מכן תפסו את הפאשיה באמצעות מלקחיים מעוקלים והוציאו אותה על ידי משיכה, תוך חשיפת הגידים בקצה הדיסטלי של הגפה האחורית. לאחר מכן, הכניסו זוג מלקחיים ישרים עם קצוות דקים במיוחד בין הגיד הדיסטלי של שריר TA לשריר EDL. הפרידו את השרירים על ידי החלקת המלקחיים לכיוון הקצה הפרוקסימלי של השרירים.
מחזירים את המלקחיים לקצה הדיסטלי וחותכים את הגיד הדיסטלי. תפסו בעדינות את הגיד הדיסטלי של ה-TA בעזרת מלקחיים מעוקלים והרימו את השריר מעלה ומעל החיבור הפרוקסימלי שלו. כדי לחתוך בזהירות את הגיד הפרוקסימלי, חותכים את הקצה השני הכי קרוב שאפשר לחיבור שלו ומעבירים את ה- TA לצלחת פטרי.
לאחר מכן השתמשו במלקחיים הישרים עם קצוות עדינים במיוחד כדי להיכנס מתחת לגיד הדיסטלי של ה-EDL ולהחליק את המלקחיים לכיוון הקצה הפרוקסימלי של השריר כדי להפריד את השרירים זה מזה. מחזירים את המלקחיים לקצה הדיסטלי וחותכים את הגיד הדיסטלי מבלי לפגוע בשריר. על ידי אחיזה עדינה בגיד הדיסטלי של EDL עם מלקחיים מעוקלים, הרימו את השריר למעלה ומעל החיבור הפרוקסימלי שלו כדי לחתוך בזהירות את הגיד הפרוקסימלי קרוב ככל האפשר לחיבור שלו.
חותכים את הקצה השני ומעבירים את שריר ה-EDL לצלחת פטרי. חזור על ההליך עבור הגפה האחורית השנייה. השתמש במלקחיים ישרים עם קצוות עדינים במיוחד כדי להגיע בין גיד אכילס לבין עצמות הגפיים האחוריות התחתונות.
החליקו את המלקחיים לכיוון הקצה הפרוקסימלי של השריר כדי להפריד את השריר מהעצמות. מחזירים את המלקחיים לקצה הדיסטלי וחותכים את הגיד הדיסטלי. משוך את שריר הגסטרוקנמיוס או GA למעלה ומעל הפיבולה.
כדי לאתר את גיד הסולאוס הפרוקסימלי. הכנס את המלקחיים הישרים בין שרירי הסולאוס לשרירי GA והזז את המלקחיים לכיוון הקצה הדיסטלי של השרירים כדי להפריד את הסולאוס מה- GA. עכשיו לחתוך את גיד הסולאוס הפרוקסימלי. תפסו אותו במלקחיים מעוקלות והרימו בזהירות את הסו כדי לגשת לגיד הדיסטלי שלו.
חותכים את הגיד הדיסטלי כדי לבודד את הסולאוס מה-GA ומניחים את הסולאוס בצלחת פטרי המכילה את מדיום השטיפה. לאחר מכן חותכים את GA ומניחים אותו בצלחת פטרי. כדי לבודד את שריר התלת ראשי, השתמשו במלקחיים ישרים בעלי קצוות דקים במיוחד כדי להגיע בין התלת ראשי לעצם ההומרוס והחליקו את המלקחיים לכיוון הקצה הפרוקסימלי של השריר כדי להפריד את השריר מהעצם.
לאחר מכן, חתכו את הקצה הדיסטלי של שריר התלת ראשי ובעזרת מלקחיים מעוקלים משכו אותו למעלה ומעל המרפק כדי לגשת לגיד הפרוקסימלי. חותכים את הגיד הפרוקסימלי של התלת ראשי ומעבירים את השריר לצלחת פטרי. חזור על ההליך עבור ארבעת הגפיים האחרות.
כדי להסיר את הפרווה ואת העור מן הלסת, להשתמש מספריים לעשות חתך 0.5 ס"מ מתחת לעין, חיתוך בכיוון קאודלי. לאחר מכן באמצעות האגודלים והאצבעות המורות של שתי הידיים, צבטו בכל צד של החתך והסירו את העור על ידי משיכתו כלפי מעלה ומטה. אתר את הגיד העיקרי של המעסה בצד הקאודלי מתחת לעין והכנס את להב האזמל השטוח בין העצם לשריר כדי לחתוך את הגיד.
תפוס את גיד המסה העיקרי עם מלקחיים מעוקלים וחתך אותו עם להב אזמל או מספריים בכיוון הרוסטרלי כדי להפריד את שריר המסה מעצם הלסת. מניחים את שריר המסה המבודד בצלחת הפטרי וחוזרים על ההליך עבור שריר המסה השני. השתמש מספריים לעשות thoracotomy באמצע עצם החזה לחתוך דרך עצם החזה.
חשוף את הסרעפת על ידי חיתוך 360 מעלות דרך כלוב הצלעות. לאחר מכן כדי להפריד את פלג הגוף העליון מהבטן השתמש במספריים כדי לחתוך דרך קנה הנשימה, הוושט, הווריד הנבוב ואבי העורקים הבטן. לאחר מכן, באמצעות מספריים, לבצע laparotomy סנטימטר אחד מתחת עצם החזה ולעשות לחתוך סביב 360 מעלות.
מניחים את המספריים הסגורים בין כלוב הצלעות לאיברי הבטן ולוחצים כלפי מטה. משכו בעדינות את כלוב הצלעות כדי להפריד אותו מאיברי הבטן. כדי להפריד את הסרעפת מכלוב הצלעות, החזיקו את הסרעפת באופן רופף בין שתי אצבעות וחתכו דרך כלוב הצלעות במספריים.
חותכים את הסרעפת קרוב ככל האפשר לצלעות סביב 360 מעלות ומניחים את הסרעפת המבודדת בצלחת פטרי. טחנו את השרירים המבודדים בזה אחר זה על ידי חיתוך שלהם לחתיכות של כמילימטר. מעבירים את השרירים הטחונים לצינור חרוטי של 15 ליטר המכיל חמישה ליטרים של חיץ דיסוציאציה, ודגרים על הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות באמבט מים רועד במהירות של 60 סיבובים לדקה.
לאחר עיכול אנזימטי של השרירים הטחונים, להעביר את ההשעיה מצינור 15 מיליליטר לצינור 50 מיליליטר. באמצעות מזרק 10 מיליליטר מצויד מחט 20 מד, להשהות מחדש את הדגימה על ידי משיכת אותו למעלה ולמטה דרך המחט חמש פעמים. משכו את תרחיף התא לתוך המזרק וסננו את הדגימה לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר המצויד במסננת תאים מלמעלה.
כדי לאחזר את כל התאים מונו גרעין, לשטוף את הצינור החרוטי ריק עם 20 מיליליטר של מדיה לשטוף ויוצקים אותו דרך המסננת כדי לשלב עם הדגימה מתוח. אחזר את הנפח הנותר מתחת למסננת התא עם פיפטה P1000. בעקבות דיסוציאציה של רקמות וצביעת נוגדנים, תאי גזע של שרירי השלד או MuSCs ואבות אדיפוגניים פיברו או FAPs משרירים בודדים טוהרו על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות.
לאחר גיוט ראשוני לזיהוי התאים ולהפרדת הסינגלים מכפילים, נקבעו שערים עוקבים באמצעות פקדי FMO לזיהוי ספי צביעה. דגימת הכתם הייתה מגודרת ואוכלוסיית ה- CD31 החיובית ל- SCA1 והאוכלוסייה השלילית CD45 המתאימה ל- FAPs מויינה לשפופרת איסוף נפרדת. האוכלוסייה השלילית הכפולה גודרה עוד יותר כדי למיין את האוכלוסייה החיובית VCA המתאימה ל- MuSCs.
המתלים החד-תאיים של שריר הסרעפת והתלת ראשי, בניגוד לאחרים, היו בעלי שכיחות יחסית גבוהה יותר של MuSCs מאשר FAPs. צביעת EDU, למרות שהיא חזקה, הצביעה על הבדל בשברים של תאים חיוביים ל-EDU עבור שני סוגי תאי הגזע ועל פני השרירים השונים. עם זאת, עבור כל הרקמות, החלק הממוצע של MuSCs חיוביים ל-EDU היה גבוה יותר מזה של FAPs חיוביים ל-EDU.
MuSCs שבודדו מ-EDL ו-GA הראו שילוב EDU נמוך משמעותית בהשוואה לאלו של TA, דיאפרגמה, gracilis או תלת-ראשי. באופן דומה, שונות משמעותית בשילוב EDU נצפתה גם ב- FAPs שבודדו משרירים שונים. לבסוף, טוהר התאים אושר עם צביעה immunofluorescent, המציין את הספציפיות של פרוטוקול בידוד תאי גזע.
השלב הקריטי ביותר הוא העיכול המכני של הרקמה. כאשר חותכים את הרקמה יותר מדי, הכדאיות יורדת. כאשר הרקמה נחתכת מעט מדי, הצלופח יורד.
ניתן לשלב את הפרוטוקול עם בדיקות המודדות את התנהגות התא, כגון השתלה לאחר השתלה כדי להבין טוב יותר את תפקודי תאי הגזע in vivo. טכניקה זו עשויה לענות על השאלה האם הבדלים בהתנהגות תאי גזע בתוך שרירים בודדים יכולים לתרום לפנוטיפים של מחלות ולמחלות המאופיינות בדפוסים ייחודיים של שרירים מושפעים.
