Este protocolo es significativo porque permite el estudio de la función de las células madre en diferentes músculos esqueléticos, profundizando nuestra comprensión de cómo contribuyen a la homeostasis, la regeneración y la progresión de la enfermedad. Usando este protocolo, podemos aislar dos poblaciones de células madre vivas de músculos específicos y estudiar cómo funcionan. Para comenzar el aislamiento muscular, rocíe el ratón sacrificado con etanol y colóquelo con el abdomen hacia arriba.
Usando tijeras, haga una incisión horizontal de 0,5 centímetros de largo en la piel abdominal. Usando ambas manos, tire de la piel para exponer el torso, así como las extremidades inferiores hasta las extremidades posteriores. Localice el gracilis o el músculo interno del muslo y con un par de pinzas curvas agárrelo y levante ligeramente el músculo.
Usando tijeras, haga una incisión de 0,5 centímetros para cortar el músculo gracilis. Repita el procedimiento en la otra pierna. Usando un bisturí, corte la fascia haciendo una incisión de 0,5 centímetros a lo largo del lado lateral de la tibia.
Luego agarre la fascia con pinzas curvas y retírela tirando, exponiendo los tendones en el extremo distal de la extremidad posterior. A continuación, inserte un par de pinzas rectas con puntas súper finas entre el tendón distal del TA y el músculo EDL. Separe los músculos deslizando los fórceps hacia el extremo proximal de los músculos.
Lleve los fórceps de vuelta al extremo distal y corte el tendón distal. Agarre suavemente el tendón distal del TA con fórceps curvos y levante el músculo hacia arriba y sobre su inserción proximal. Para cortar cuidadosamente el tendón proximal, corte el otro extremo lo más cerca posible de su unión y transfiera el TA a una placa de Petri.
Luego use los fórceps rectos con puntas súper finas para ir debajo del tendón distal de la EDL y deslice los fórceps hacia el extremo proximal del músculo para separar los músculos entre sí. Lleve los fórceps de vuelta al extremo distal y corte el tendón distal sin dañar el músculo. Al agarrar suavemente el tendón distal de EDL con fórceps curvos, levante el músculo hacia arriba y sobre su unión proximal para cortar cuidadosamente el tendón proximal lo más cerca posible de su unión.
Corte el otro extremo y transfiera el músculo EDL a una placa de Petri. Repita el procedimiento para la otra extremidad posterior. Use fórceps rectos con puntas súper finas para alcanzar entre el tendón de Aquiles y los huesos inferiores de las extremidades posteriores.
Deslice los fórceps hacia el extremo proximal del músculo para separar el músculo de los huesos. Lleve los fórceps de vuelta al extremo distal y corte el tendón distal. Tire del músculo gastrocnemio o GA hacia arriba y sobre el peroné.
Para localizar el tendón sóleo proximal. Inserte los fórceps rectos entre los músculos sóleo y GA y mueva los fórceps hacia el extremo distal de los músculos para separar el sóleo del GA. Ahora corte el tendón sóleo proximal. Agárralo con pinzas curvas y levanta con cuidado el sous para acceder a su tendón distal.
Corte el tendón distal para aislar el sóleo del AG y coloque el sóleo en la placa de Petri que contiene el medio de lavado. Luego corta el GA y colócalo en la placa de Petri. Para aislar el músculo tríceps, use fórceps rectos con puntas súper finas para alcanzar entre el tríceps y el hueso del húmero y deslice los fórceps hacia el extremo proximal del músculo para separar el músculo del hueso.
A continuación, corte el extremo distal del músculo tríceps y con pinzas curvas tire de él hacia arriba y sobre el codo para acceder al tendón proximal. Cortar el tendón proximal del tríceps y transferir el músculo a una placa de Petri. Repita el procedimiento para las otras cuatro extremidades.
Para quitar el pelaje y la piel de la mandíbula, use tijeras para hacer una incisión de 0,5 centímetros debajo del ojo, cortando en la dirección caudal. Luego, usando los pulgares y los dedos índice de ambas manos, pellizque cada lado de la incisión y retire la piel tirando de ella hacia arriba y hacia abajo. Localice el tendón principal del masetero en el lado caudal debajo del ojo e inserte la hoja de bisturí plana entre el hueso y el músculo para cortar el tendón.
Agarre el tendón del masetero mayor con pinzas curvas y córtelo con una hoja de bisturí o tijeras en la dirección rostral para separar el músculo masetero de la mandíbula. Coloque el músculo masetero aislado en la placa de Petri y repita el procedimiento para el segundo músculo masetero. Use tijeras para hacer una toracotomía en el medio del esternón y corte a través del esternón.
Exponga el diafragma cortando 360 grados a través de la caja torácica. Luego, para separar la parte superior del cuerpo del abdomen, use tijeras para cortar la tráquea, el esófago, la vena cava y la aorta abdominal. A continuación, usando tijeras, realice una laparotomía un centímetro por debajo del esternón y haga un corte alrededor de 360 grados.
Coloque las tijeras cerradas entre la caja torácica y los órganos abdominales y presione hacia abajo. Tire suavemente de la caja torácica para separarla de los órganos abdominales. Para separar el diafragma de la caja torácica, sostenga libremente el diafragma entre dos dedos y corte a través de la caja torácica con tijeras.
Corte el diafragma lo más cerca posible de las costillas alrededor de 360 grados y coloque el diafragma aislado en una placa de Petri. Picar los músculos aislados uno por uno cortándolos en trozos de aproximadamente un milímetro. Transfiera los músculos picados a un tubo cónico de 15 litros que contenga cinco litros de tampón de disociación e incube el tubo a 37 grados centígrados durante 35 minutos en un baño de agua agitante a una velocidad de 60 rotaciones por minuto.
Después de la digestión enzimática de los músculos picados, transfiera la suspensión del tubo de 15 mililitros a un tubo de 50 mililitros. Con una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 20, vuelva a suspender la muestra tirando de ella hacia arriba y hacia abajo a través de la aguja cinco veces. Extraiga la suspensión celular en la jeringa y cuele la muestra en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros equipado con un filtro celular en la parte superior.
Para recuperar todas las células mononucleadas, lave el tubo cónico vacío con 20 mililitros de medios de lavado y viértalo a través del filtro para combinarlo con la muestra filtrada. Recupere el volumen restante debajo del filtro celular con una pipeta P1000. Después de la disociación tisular y la tinción de anticuerpos, las células madre del músculo esquelético o MuSC y los progenitores fibro adipogénicos o FAP de los músculos individuales se purificaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia.
Después de la activación inicial para identificar las celdas y separar los singletes de los dobletes, se establecieron puertas posteriores utilizando controles FMO para identificar los umbrales de tinción. La muestra de tinción se cerró y la población SCA1 positiva CD31 negativa y CD45 negativa correspondiente a FAPs se clasificó en un tubo de recolección separado. La población doble negativa se cerró aún más para clasificar la población VCA positiva correspondiente a los MuSC.
Las suspensiones unicelulares del músculo diafragma y tríceps, a diferencia de las otras, tuvieron una mayor abundancia relativa de MuSC que las FAP. La tinción de EDU, aunque robusta, indicó una diferencia en las fracciones de células EDU positivas para los dos tipos de células madre y entre los diferentes músculos. Sin embargo, para todos los tejidos, la fracción media de MUSC positivos para EDU fue mayor que la de FAP positivos para EDU.
Los MuSC aislados de EDL y GA mostraron una incorporación significativamente menor de EDU en comparación con los de TA, diafragma, gracilis o tríceps. Del mismo modo, también se observó una variación significativa en la incorporación de EDU en FAP aislados de diferentes músculos. Finalmente, la pureza celular se confirmó con tinción inmunofluorescente, indicando la especificidad del protocolo de aislamiento de células madre.
El paso más crítico es la digestión mecánica del tejido. Cuando el tejido se corta demasiado, la viabilidad disminuye. Cuando el tejido se corta muy poco, la anguila disminuye.
El protocolo se puede combinar con ensayos que miden el comportamiento celular, como el injerto después del trasplante para comprender mejor las funciones de las células madre in vivo. Esta técnica puede responder si las diferencias en el comportamiento de las células madre dentro de los músculos individuales pueden contribuir a los fenotipos de enfermedades y enfermedades caracterizadas por patrones únicos de músculos afectados.
