Questo protocollo è significativo perché consente lo studio della funzione delle cellule staminali in diversi muscoli scheletrici, approfondendo la nostra comprensione di come contribuiscono all'omeostasi, alla rigenerazione e alla progressione della malattia. Utilizzando questo protocollo, possiamo isolare due popolazioni di cellule staminali vive da muscoli specifici e studiare come funzionano. Per iniziare l'isolamento muscolare, spruzzare il topo eutanasia con etanolo e posizionarlo con l'addome rivolto verso l'alto.
Usando le forbici, fai un'incisione orizzontale lunga 0,5 centimetri nella pelle addominale. Usando entrambe le mani, tirare la pelle per esporre il busto e gli arti inferiori fino agli arti posteriori. Individuare il gracilis o il muscolo interno coscia e usando un paio di pinze curve afferrare su di esso e sollevare leggermente il muscolo.
Usando le forbici, fai un'incisione di 0,5 centimetri per tagliare il muscolo gracilis. Ripeti la procedura sull'altra gamba. Usando un bisturi, tagliare la fascia facendo un'incisione di 0,5 centimetri lungo il lato laterale della tibia.
Quindi afferrare la fascia usando una pinza curva e rimuoverla tirando, esponendo i tendini all'estremità distale dell'arto posteriore. Quindi, inserire un paio di pinze dritte con punte super sottili tra il tendine distale del TA e il muscolo EDL. Separare i muscoli facendo scorrere la pinza verso l'estremità prossimale dei muscoli.
Riportare il forcipe all'estremità distale e tagliare il tendine distale. Afferrare delicatamente il tendine distale del TA con una pinza curva e sollevare il muscolo verso l'alto e sopra il suo attacco prossimale. Per tagliare con cura il tendine prossimale, tagliare l'altra estremità il più vicino possibile al suo attacco e trasferire il TA in una capsula di Petri.
Quindi utilizzare la pinza dritta con punte super sottili per andare sotto il tendine distale dell'EDL e far scorrere la pinza verso l'estremità prossimale del muscolo per separare i muscoli l'uno dall'altro. Riportare il forcipe all'estremità distale e tagliare il tendine distale senza danneggiare il muscolo. Afferrando delicatamente il tendine distale di EDL con una pinza curva, sollevare il muscolo verso l'alto e sopra il suo attacco prossimale per tagliare con cura il tendine prossimale il più vicino possibile al suo attaccamento.
Tagliare l'altra estremità e trasferire il muscolo EDL in una capsula di Petri. Ripetere la procedura per l'altro arto posteriore. Usa una pinza dritta con punte super sottili per raggiungere tra il tendine di Achille e le ossa degli arti posteriori inferiori.
Far scorrere la pinza verso l'estremità prossimale del muscolo per separare il muscolo dalle ossa. Riportare il forcipe all'estremità distale e tagliare il tendine distale. Tirare il muscolo gastrocnemio o GA su e sopra il perone.
Per localizzare il tendine soleo prossimale. Inserire la pinza dritta tra i muscoli soleo e GA e spostare la pinza verso l'estremità distale dei muscoli per separare il soleo dal GA. Ora taglia il tendine soleo prossimale. Afferralo con una pinza curva e solleva con attenzione il sous per accedere al suo tendine distale.
Tagliare il tendine distale per isolare il soleo dall'AG e posizionare il soleo nella capsula di Petri contenente il mezzo di lavaggio. Quindi tagliare il GA e metterlo nella piastra di Petri. Per isolare il muscolo tricipite, utilizzare una pinza dritta con punte super sottili per raggiungere tra i tricipiti e l'omero e far scorrere la pinza verso l'estremità prossimale del muscolo per separare il muscolo dall'osso.
Quindi, tagliare l'estremità distale del muscolo tricipite e usando una pinza curva tirarlo su e sopra il gomito per accedere al tendine prossimale. Tagliare il tendine prossimale del tricipite e trasferire il muscolo in una capsula di Petri. Ripetere la procedura per gli altri quattro arti.
Per rimuovere la pelliccia e la pelle dalla mascella, usare le forbici per fare un'incisione di 0,5 centimetri sotto l'occhio, tagliando nella direzione caudale. Quindi, usando i pollici e gli indici di entrambe le mani, pizzicare su ciascun lato dell'incisione e rimuovere la pelle tirandola verso l'alto e verso il basso. Individuare il tendine maggiore del massetere nel lato caudale sotto l'occhio e inserire la lama piatta del bisturi tra l'osso e il muscolo per tagliare il tendine.
Afferrare il tendine massetere maggiore con una pinza curva e tagliarlo con una lama di bisturi o forbici nella direzione rostrale per separare il muscolo massetere dalla mandibola. Posizionare il muscolo massetere isolato nella piastra di Petri e ripetere la procedura per il secondo muscolo massetere. Usa le forbici per fare una toracotomia nel mezzo dello sterno e tagliare lo sterno.
Esporre il diaframma tagliando a 360 gradi attraverso la gabbia toracica. Quindi per separare la parte superiore del corpo dall'addome usa le forbici per tagliare la trachea, l'esofago, la vena cava e l'aorta addominale. Successivamente, usando le forbici, preforma una laparotomia un centimetro sotto lo sterno e fai un taglio di circa 360 gradi.
Posizionare le forbici chiuse tra la gabbia toracica e gli organi addominali e premere verso il basso. Tirare delicatamente la gabbia toracica per separarla dagli organi addominali. Per separare il diaframma dalla gabbia toracica, tenere liberamente il diaframma tra due dita e tagliare la gabbia toracica con le forbici.
Tagliare il diaframma il più vicino possibile alle costole di 360 gradi e posizionare il diaframma isolato in una capsula di Petri. Tritare i muscoli isolati uno per uno tagliandoli in pezzi di circa un millimetro. Trasferire i muscoli tritati in un tubo conico da 15 litri contenente cinque litri di tampone di dissociazione e incubare il tubo a 37 gradi Celsius per 35 minuti in un bagno d'acqua agitante ad una velocità di 60 rotazioni al minuto.
Dopo la digestione enzimatica dei muscoli tritati, trasferire la sospensione dal tubo da 15 millilitri a un tubo da 50 millilitri. Utilizzando una siringa da 10 millilitri dotata di un ago da 20 gauge, risospendere il campione tirandolo su e giù attraverso l'ago cinque volte. Aspirare la sospensione cellulare nella siringa e filtrare il campione in un nuovo tubo conico da 50 millilitri dotato di un filtro cellulare sulla parte superiore.
Per recuperare tutte le celle mononucleate, lavare il tubo conico vuoto con 20 millilitri di mezzo di lavaggio e versarlo attraverso il filtro per combinarlo con il campione filtrato. Recuperare il volume rimanente sotto il filtro cellulare con una pipetta P1000. Dopo la dissociazione tissutale e la colorazione degli anticorpi, le cellule staminali muscolari scheletriche o MuSC e i progenitori fibro adipogeni o FAP dei singoli muscoli sono stati purificati mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.
Dopo il gating iniziale per identificare le cellule e separare i singoletti dai doppietti, sono stati impostati i cancelli successivi utilizzando i controlli FMO per identificare le soglie di colorazione. Il campione di colorazione è stato controllato e la popolazione CD31 negativa e CD45 negativa SCA1 positiva corrispondente ai FAP è stata smistata in una provetta di raccolta separata. La popolazione doppia negativa è stata ulteriormente controllata per ordinare la popolazione VCA positiva corrispondente ai MuSC.
Le sospensioni monocellulari del muscolo diaframma e tricipite, a differenza delle altre, avevano una maggiore abbondanza relativa di MuSC rispetto alle FAP. La colorazione EDU, sebbene robusta, ha indicato una differenza nelle frazioni di cellule EDU positive per i due tipi di cellule staminali e tra i diversi muscoli. Per tutti i tessuti, tuttavia, la frazione media di MuSC EDU positivi era superiore a quella dei FAP EDU positivi.
I MuSC isolati da EDL e GA hanno mostrato un'incorporazione di EDU significativamente inferiore rispetto a quelli di TA, diaframma, gracile o tricipite. Allo stesso modo, variazioni significative nell'incorporazione dell'EDU sono state osservate anche nei FAP isolati da muscoli diversi. Infine, la purezza cellulare è stata confermata con colorazione immunofluorescente, indicando la specificità del protocollo di isolamento delle cellule staminali.
Il passo più critico è la digestione meccanica del tessuto. Quando il tessuto viene tagliato troppo, la vitalità diminuisce. Quando il tessuto viene tagliato troppo poco, l'ANGUILLA diminuisce.
Il protocollo può essere combinato con saggi che misurano il comportamento cellulare, come l'attecchimento dopo il trapianto per comprendere meglio le funzioni delle cellule staminali in vivo. Questa tecnica può rispondere se le differenze nel comportamento delle cellule staminali all'interno dei singoli muscoli possono contribuire a fenotipi di malattia e malattie caratterizzate da modelli unici di muscoli colpiti.
