이 프로토콜은 다양한 골격근에 걸친 줄기 세포 기능을 연구할 수 있게 하여 줄기 세포가 항상성, 재생 및 질병 진행에 어떻게 기여하는지에 대한 이해를 심화할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜을 사용하여 특정 근육에서 살아있는 줄기 세포의 두 집단을 분리하고 작동 방식을 연구할 수 있습니다. 근육 격리를 시작하려면 안락사 된 마우스에 에탄올을 뿌리고 복부가 위를 향하도록 놓습니다.
가위를 사용하여 복부 피부에 0.5cm 길이의 수평 절개를하십시오. 양손으로 피부를 당겨 몸통과 하지가 뒷다리까지 노출되도록 합니다. 그라실리스 또는 허벅지 안쪽 근육을 찾아 한 쌍의 구부러진 집게를 사용하여 근육을 잡고 근육을 약간 들어 올립니다.
가위를 사용하여 0.5cm 절개하여 그라실리스 근육을 잘라냅니다. 다른 다리에서도 절차를 반복하십시오. 메스를 사용하여 경골의 측면을 따라 0.5 센티미터 절개를하여 근막을 자릅니다.
그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 근막을 잡고 잡아 당겨 제거하여 뒷다리의 말단부에 힘줄이 노출되도록 합니다. 다음으로, TA의 원위 힘줄과 EDL 근육 사이에 초미세 팁이 있는 한 쌍의 직선 집게를 삽입합니다. 집게를 근육의 근위 끝으로 밀어 근육을 분리합니다.
집게를 말단부로 되돌리고 원위부 힘줄을 자릅니다. 구부러진 집게로 TA의 원위 힘줄을 부드럽게 잡고 근위 부착물 위로 근육을 들어 올립니다. 근위 힘줄을 조심스럽게 자르려면 다른 쪽 끝을 부착물에 가장 가깝게 자르고 TA를 페트리 접시로 옮깁니다.
그런 다음 매우 미세한 팁이 있는 직선 집게를 사용하여 EDL의 원위 힘줄 아래로 이동하고 집게를 근육의 근위 끝으로 밀어 근육을 서로 분리합니다. 집게를 말단부로 되돌리고 근육을 손상시키지 않고 원위 힘줄을 자릅니다. 구부러진 집게로 EDL의 원위 힘줄을 부드럽게 잡고 근위 부착물 위로 근육을 들어 올려 근위 힘줄을 부착물에 최대한 가깝게 조심스럽게 자릅니다.
다른 쪽 끝을 자르고 EDL 근육을 페트리 접시에 옮깁니다. 다른 뒷다리에 대해 절차를 반복하십시오. 아킬레스건과 하부 뒷다리 뼈 사이에 닿도록 매우 미세한 팁이 있는 직선 집게를 사용합니다.
집게를 근육의 근위 끝으로 밀어 근육과 뼈를 분리합니다. 집게를 말단부로 되돌리고 원위부 힘줄을 자릅니다. 비복근 또는 GA 근육을 비골 위로 당깁니다.
근위 가자미근 힘줄을 찾습니다. 가자미근과 GA 근육 사이에 직선 집게를 삽입하고 집게를 근육의 말단부로 움직여 가자미근과 GA를 분리합니다. 이제 근위 가자미근 힘줄을 자릅니다. 구부러진 집게로 잡고 수스를 조심스럽게 들어 올려 말단 힘줄에 접근합니다.
GA에서 가자미근을 분리하기 위해 원위 힘줄을 자르고 세척 매체가 들어 있는 페트리 접시에 가자미근을 놓습니다. 그런 다음 GA를 자르고 페트리 접시에 넣으십시오. 삼두근을 분리하려면 삼두근과 상완골 사이에 닿을 수 있는 매우 미세한 팁이 있는 직선 집게를 사용하고 집게를 근육의 근위 끝으로 밀어 근육과 뼈를 분리합니다.
다음으로 삼두근의 말단부를 자르고 구부러진 집게를 사용하여 팔꿈치 위로 당겨 근위 힘줄에 접근합니다. 삼두근의 근위 힘줄을 자르고 근육을 페트리 접시로 옮깁니다. 다른 네 팔다리에 대해 절차를 반복하십시오.
턱에서 모피와 피부를 제거하려면 가위를 사용하여 눈 아래 0.5 센티미터를 절개하여 꼬리 방향으로 자릅니다. 그런 다음 양손의 엄지와 검지를 사용하여 절개 부위의 양쪽을 꼬집고 피부를 위아래로 당겨 제거합니다. 교근의 주요 힘줄을 눈 아래 꼬리 쪽에 놓고 납작한 메스 칼날을 뼈와 근육 사이에 삽입하여 힘줄을 자릅니다.
구부러진 집게로 주요 교근 힘줄을 잡고 메스 날이나 가위로 방향으로 잘라 교근과 턱뼈를 분리합니다. 분리된 교근을 페트리 접시에 넣고 두 번째 교근에 대한 절차를 반복합니다. 가위를 사용하여 흉골 중앙에 개흉술을 하고 흉골을 자릅니다.
흉곽을 통해 360도 절단하여 다이어프램을 노출시킵니다. 그런 다음 상체를 복부에서 분리하려면 가위를 사용하여 기관, 식도, 대정맥 및 복부 대동맥을 절단합니다. 다음으로 가위를 사용하여 흉골 아래 1cm에 개복술을 하고 약 360도 절단합니다.
흉곽과 복부 장기 사이에 닫힌 가위를 놓고 아래로 누릅니다. 흉곽을 부드럽게 당겨 복부 장기에서 분리합니다. 다이어프램을 흉곽에서 분리하려면 두 손가락 사이에 다이어프램을 느슨하게 잡고 가위로 흉곽을 자릅니다.
다이어프램을 리브에 최대한 가깝게 약 360도 자르고 분리된 다이어프램을 페트리 접시에 넣습니다. 고립 된 근육을 약 1 밀리미터의 조각으로 잘라서 하나씩 잘라냅니다. 다진 근육을 5 리터의 해리 완충액이 들어있는 15 리터의 원추형 튜브로 옮기고 분당 60 회전 속도로 진탕 수조에서 35 분 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다.
다진 근육의 효소 소화 후, 현탁액을 15 밀리리터 튜브에서 50 밀리리터 튜브로 옮긴다. 20 게이지 바늘이 장착 된 10 밀리리터 주사기를 사용하여 바늘을 통해 위아래로 5 번 당겨 샘플을 다시 일시 중단합니다. 세포 현탁액을 주사기에 넣고 상단에 세포 스트레이너가 장착된 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브에 샘플을 변형시킵니다.
모든 단일 유핵 세포를 회수하려면 빈 원추형 튜브를 20ml의 세척 매체로 세척하고 스트레이너를 통해 부어 변형된 샘플과 결합합니다. P1000 피펫으로 셀 스트레이너 아래에 남아 있는 부피를 회수합니다. 조직 해리 및 항체 염색에 이어, 개별 근육으로부터의 골격근 줄기 세포 또는 MuSC 및 섬유 지방성 전구체 또는 FAP를 형광 활성화 세포 분류에 의해 정제하였다.
세포를 식별하고 이중선에서 싱글렛을 분리하기 위한 초기 게이팅 후, 염색 역치를 식별하기 위해 FMO 대조군을 사용하여 후속 게이트를 설정했습니다. 염색 샘플을 게이팅하고, FAPs에 상응하는 SCA1 양성 CD31 음성 및 CD45 음성 집단을 별도의 수집 튜브로 분류하였다. 이중 음성 모집단은 MuSC에 해당하는 VCA 양성 모집단을 정렬하기 위해 추가로 게이트되었습니다.
횡격막 및 삼두근 근육 단세포 현탁액은 다른 것과 달리 FAP보다 MuSC의 상대적 풍부도가 더 높았습니다. EDU 염색은 강력하지만 두 가지 줄기 세포 유형과 서로 다른 근육에 걸쳐 EDU 양성 세포의 분획에 차이가 있음을 나타냅니다. 그러나 모든 조직에서 EDU 양성 MuSC의 평균 분율은 EDU 양성 FAP의 평균 분율보다 높았습니다.
EDL 및 GA에서 분리된 MuSC는 TA, 다이어프램, 그라실리스 또는 삼두근에서 분리된 MuSC에 비해 EDU 통합이 현저히 낮았습니다. 유사하게, EDU 혼입의 상당한 변화는 상이한 근육으로부터 분리된 FAP에서도 관찰되었다. 마지막으로, 면역형광염색으로 세포 순도를 확인하였으며, 이는 줄기세포 분리 프로토콜의 특이성을 나타낸다.
가장 중요한 단계는 조직의 기계적 소화입니다. 조직이 너무 많이 절단되면 생존력이 떨어집니다. 조직이 너무 적게 절단되면 EEL이 감소합니다.
이 프로토콜은 생체 내 줄기 세포 기능을 더 잘 이해하기 위해 이식 후 생착과 같은 세포 거동을 측정하는 분석과 결합할 수 있습니다. 이 기술은 개별 근육 내에서 줄기 세포 행동의 차이가 질병 표현형 및 영향을받는 근육의 독특한 패턴을 특징으로하는 질병에 기여할 수 있는지 여부에 대한 답을 줄 수 있습니다.
