Органоиды и сфероиды, будучи очень хрупкими, серьезно повреждаются при обращении. Наш протокол гарантирует, что эти 3D-растущие структуры остаются нетронутыми во время различных процессов, тем самым повышая точность, воспроизводимость, надежность и повторяемость. Исследователь может культивировать, замораживать, оттаивать, обрабатывать, окрашивать, маркировать и исследовать целые органоиды и сфероиды под различными микроскопами, пока они остаются нетронутыми в гидрогеле в одном многоцелевом устройстве.
Это позволяет создавать модель заболевания и отслеживать последовательные шаги в одном многоцелевом устройстве. Технология обеспечивает большую точность при исследовании биомаркеров для диагностики и прогноза заболеваний. Этот метод может быть применен к любой 3D-системе выращивания, включая органоиды, сфероиды, отдельные клетки или живые организмы.
Чтобы начать органоидную или сфероидную культуру, поместите правильно размороженный гидрогель на лед внутрь ламинарной проточной вытяжки на 15 минут. Кроме того, держите трубку, содержащую гранулу гепатоцеллюлярной карциномы, или клеток HEPG2, на льду. Затем нанесите от 30 до 35 микролитров 100% гидрогеля в нише предварительно нагретого многоцелевого устройства для создания капли геля, поместите 10 000 клеток HEPG2 в центр верхней части капли гидрогеля и инкубируйте установку при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут.
После инкубации покройте каплю гидрогеля 200 микролитрами модифицированной орлиной среды Dulbecco, или DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, или FBS. Поместите крышку на устройство должным образом, пропуская поток газа, прежде чем поместить его в инкубатор. Через день кормите клетки 200 микролитрами DMEM, содержащими 10% FBS.
Проверьте рост сфероидов под перевернутым микроскопом. Перед началом иммунофлуоресцентной маркировки органоидов разогрейте необходимые среды и растворы до 37 градусов Цельсия. Аспирируйте клеточную культурную среду, окружающую гидрогель, перед добавлением 200 микролитров 4%-го параформальдегида, предварительно нагретого до 37 градусов Цельсия, и зафиксируйте его, поместив в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15-30 минут.
Затем аспирировать фиксатор и промыть раствор для иммунофлуоресцентной маркировки, или SIF, предварительно подогретый до 37 градусов Цельсия три раза в течение 10 минут каждый. Добавьте дистиллированную воду в область, окружающую нишу, чтобы обеспечить влажность, прежде чем переходить к следующим шагам. Аспирируйте SIF, окружающий гидрогель, и добавьте 100 микролитров предварительно разогретого раствора первичного антитела в SIF к гидрогелю перед инкубацией при 37 градусах Цельсия в течение 30-60 минут.
Затем аспирировать раствор первичного антитела и промыть предварительно подогретым до 37 градусов Цельсия SIF три раза в течение 10 минут каждый. После промывки аспирируют оставшийся SIF и добавляют 100 микролитров предварительно подогретого раствора вторичных антител в SIF к гидрогелю. Инкубируйте гидрогель при температуре 37 градусов Цельсия в темноте в течение 30-60 минут.
После инкубации аспирируют раствор вторичных антител и промывают каплю гидрогеля PBS при температуре 37 градусов Цельсия три раза в темноте в течение 10 минут каждая. Затем аспирируют остаточный PBS и инкубируют гидрогель со 100 микролитрами ядерного пятна ДНК, содержащего монтажную среду или глицерин при 37 градусах Цельсия в темноте. Заполните нишу глицерином, чтобы избежать высыхания, прежде чем плотно закрыть многоцелевое устройство, содержащее гидрогель.
Чтобы исследовать органоиды с помощью конфокальной микроскопии, установите параметры микроскопа, следуя инструкциям, приведенным в рукописи. Чтобы заморозить органоиды, аспирировать среду клеточной культуры, добавить 200 микролитров предварительно нагретого морозильного раствора и инкубировать образец при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Плотно закройте крышку устройства, прежде чем поместить его внутрь пенопластовой коробки.
Поместите эту пенопластовую коробку в другую пенопластовую коробку и плотно закройте обе пенопластовые коробки. Держите коробку при минус 20 градусах Цельсия в течение двух часов, затем оставьте ее на ночь в морозильной камере при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы хранить органоиды дольше шести месяцев, извлеките многоцелевое устройство, содержащее органоиды, из коробок и перенесите его в резервуар для жидкого азота.
Чтобы разморозить органоиды, выньте многоцелевое устройство, содержащее образец, из морозильной камеры или резервуара с жидким азотом и поместите его непосредственно в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия. После размораживания осторожно аспирируйте смесь среды и замерзающего раствора, прежде чем добавлять свежую среду и приступая к изображению целого органоидного гидрогеля. При живой визуализации растущие органоиды внутри гидрогеля стали видны через три-пять дней после введения клеточной гранулы, особенно на периферии купола гидрогеля.
Здесь показаны временные ряды изображений на разных уровнях гидрогеля, содержащего сфероиды, под инвертированным фазовым контрастным микроскопом. Конфокальные микроскопические изображения целых живых органоидов после живого окрашивания клеточной мембраны и ядра показали одинаковую плотность маркировки на периферии и в центре. Кроме того, иммунофлуоресцентная маркировка стероидов всего типа может быть успешно выполнена с одним антителом, двумя антителами, а также тремя антителами, устраняя любую необходимость в дополнительных этапах лечения.
Репрезентативный анализ демонстрирует два иммунофлуоресцентных меченых органоида дыхательных путей в устройстве. SEM-изображения целых сфероидов в многоцелевом устройстве и 10 изображений секционированных стероидов указывали на хорошо сохранившуюся 3D-архитектуру сфероидов, цитоплазматических органелл и других ультраструктурных клеточных особенностей, демонстрируя эффективность описанного протокола. Неравномерность на границах купола гидрогеля была очевидна после замораживания образцов.
Однако размеры и округлость сфероидов остались похожими. Миграция клеток на поверхности культуры наблюдалась после размораживания замороженных образцов. Техника очень проста.
Тем не менее, исследователь должен быть очень мягким при аспирации или добавлении любых жидкостей, окружающих каплю гидрогеля, чтобы предотвратить повреждение образца. Исследователь может посмотреть на один и тот же образец в одном устройстве с помощью высокотехнологичного микроскопа и провести корреляционное исследование.
