Синхронизируя клетки в профазной и затем истощая белок-мишень на определенной стадии, этот метод может идентифицировать временно различные функции специфических белков. Условное истощение белков на определенных стадиях миоза предотвращает остаточные эффекты, которые традиционный миотический мутант может иметь на более поздних стадиях. Этот метод может быть использован для изучения начинающегося дрожжевого митоза и других организмов, которые не подвергаются разрушению ядерной оболочки.
Кроме того, этот метод может быть использован в других организмах для изучения событий клеточного цикла до разрушения ядерной оболочки. Для начала сделайте агаровую прокладку, которая будет использоваться для создания монослоя клеток для визуализации. Отрежьте и выбросьте крышку и нижнюю треть 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубки, чтобы создать цилиндр, который будет служить формой для агаровой прокладки.
Поместите цилиндр с вырезанной микроцентрифужной трубкой на чистую стеклянную горку с верхней частью трубки вверх ногами, сидя на слайде. Сделайте шесть миллилитров 5% раствора агара в 50-миллилитровом стакане. Отрежьте кончик пипетки, чтобы сделать более крупное отверстие, и пипетку примерно 500 микролитров расплавленного агара в микроцентрифужную трубку.
Дайте ему постоять при комнатной температуре, пока агар не затвердеет. Чтобы подготовить дрожжевые клетки, открутите 200 микролитров культуры споруляции при 800 г в течение двух минут в одномиллилитрных микроцентрифужных трубках. Выбросьте 180 микролитров супернатанта.
Повторно суспендируйте гранулу в оставшемся супернатанте, закручивая и щелкая трубкой. Пипетка шесть микролитров концентрированных ячеек на крышке скользит в середине камеры на месте с ConA. Удерживайте цилиндр с помощью агаровой прокладки и осторожно соскользните его со стеклянной горки.
Убедитесь, что агар полностью плоский на дне и, используя нижнюю часть наконечника пипетки, приложите небольшое давление к форме микроцентрифуги, чтобы агаровая прокладка была немного вытолкнута над границей трубки. Затем переверните форму таким образом, чтобы агаровая прокладка была обращена вниз к камере. Используйте щипцы, чтобы аккуратно поместить агаровую прокладку поверх клеток, а кончик пипетки осторожно скользить подушечке агара вокруг камеры от 10 до 20 раз, чтобы создать монослой клеток на крышке.
Держите агаровую прокладку в камере в течение 12-15 минут. Далее перекладывают два миллилитра культуры споруляции в две микроцентрифужные трубки и вращают при 15 700 г в течение двух минут. После переноса супернатанта в чистые микроцентрифужные трубки снова вращаются в том же состоянии и собирают супернатант в чистые микроцентрифужные трубки.
Добавьте два миллилитра супернатанта по каплям в камеру, содержащую агаровую прокладку. Как только жидкость достигнет верхней части камеры, агаровая подушка, скорее всего, будет плавать. Аккуратно снимите подушечку агара щипцами и выбросьте.
Поместите крышку размером 24 на 50 миллиметров в верхнюю часть камеры, чтобы предотвратить испарение во время визуализации. Чтобы настроить фильм на микроскопе, поместите крышку внутрь держателя слайда. Прикрепите формовочную глину к боковой части крышки, чтобы она была надежно закреплена в держателе слайда.
Откройте программное обеспечение для получения изображений. Используйте грубые и тонкие ручки регулировки, чтобы сфокусировать ячейки с помощью DIC или яркого поля. В главном меню программного обеспечения для получения изображений нажмите «Файл», выберите «Получить», и появятся четыре окна.
В окне с именем Resolve 3D нажмите на значок колбы Erlenmeyer. Откроется окно под названием Design Run Experiment, содержащее элементы управления для настройки эксперимента по настройке покадрового фильма. На вкладке Конструктор перейдите на вкладку Секционирование.
Установите флажок рядом с пунктом Z-секционирование и установите расстояние между оптическими секциями в один микрометр, а число оптических секций — в пять. Далее под вкладкой Каналы нажмите на значок плюса и выберите соответствующий канал. Затем установите флажок Рядом с эталонным изображением и установите положение Z в середину образца в раскрывающемся меню.
Выберите значение коэффициента пропускания и времени экспозиции в раскрывающемся меню. На вкладке Покадровая съемка установите флажок Замедленная съемка и введите значения для минут и часов, чтобы определить временной интервал получения изображения. Установите флажок Поддерживать фокус с конечным фокусом, чтобы предотвратить дрейф сцены во время фильма.
А на вкладке Точки установите флажок Рядом со Списком точек посещения. В главном меню нажмите Вид и выберите Список точек. Переместите сцену в область камеры, которая показывает монослой клеток.
Нажмите «Пометить точку» в окне «Список точек». Переместите рабочую область, чтобы выбрать от 25 до 30 точек без какого-либо перекрытия, чтобы избежать переэкспонирования ячеек и изображения каждого поля во время каждого временного курса. В окне Список точек выберите Откалибровать все, чтобы задать конечную направленность для каждой точки.
На вкладке Выполнить сохраните файл в соответствующем месте назначения на компьютере. В окне Запуск эксперимента нажмите кнопку Воспроизвести, чтобы запустить фильм. Откройте программное обеспечение Fiji.
Откройте каналы DIC и mCherry. Получите одну проекцию максимальной интенсивности канала mCherry, щелкнув Изображение, а затем Стеки и Z Project и выберите Максимальная интенсивность в раскрывающемся меню. Чтобы объединить каналы DIC и mCherry в одном изображении, нажмите «Изображение», «Цвет» и выберите «Объединить каналы».
Следуйте за одной клеткой через мейоз. После завершения мейоза II регистрируют количество масс ДНК. В клетках дикого типа с фоном якоря обычно есть четыре массы ДНК в конце мейоза II, представляющие четыре продукта мейоза.
В небольшой части клеток видны только три массы после мейоза II.Когда Ctf19-FRB закрепляется во время высвобождения профазы I, примерно 47% клеток проявляют более четырех масс ДНК по завершении мейоза, что свидетельствует о дефекте прикрепления кинетохоров и микротрубочек. При закреплении Ctf19-FRB, либо после сборки кинетохора, но до мейоза I, либо после мейоза II, примерно 16% клеток демонстрируют дополнительные массы ДНК. Одной из наиболее важных частей этого протокола является добавление супернатанта по каплям в вашу камеру, чтобы избежать нарушения вашего монослоя.
Кроме того, обратите внимание на время, необходимое для подготовки к визуализации, чтобы учесть ее в анализе. Изменяя флуоресцентно упакованные белки, эта процедура может быть использована для ответа на вопросы, касающиеся продолжительности клеточного цикла, сегрегации хромосом, обилия белка и локализации белка.
