Ao sincronizar as células na prófase um e, em seguida, esgotar a proteína-alvo em um estágio específico, esse método pode identificar funções temporariamente distintas de proteínas específicas. Proteínas condicionalmente esgotantes em estágios específicos da miose impedem os efeitos residuais que um mutante miotótico tradicional pode ter em estágios posteriores. Este método poderia ser usado para estudar a mitose de levedura em brotamento e outros organismos que não sofrem quebra do envelope nuclear.
Além disso, este método pode ser usado em outros organismos para estudar eventos do ciclo celular antes da quebra do envelope nuclear. Para começar, faça uma almofada de ágar que será usada para criar uma monocamada de células para imagens. Corte e descarte a tampa e o fundo de um terço de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para criar um cilindro que servirá como um molde para a almofada de ágar.
Coloque o cilindro do tubo de microcentrífuga cortado em uma lâmina de vidro limpa com a parte superior do tubo de cabeça para baixo, sentada no slide. Faça seis mililitros de uma solução de ágar a 5% em um copo de 50 mililitros. Corte a ponta da pipeta para fazer uma abertura maior e pipete aproximadamente 500 microlitros de ágar derretido no tubo de microcentrífuga.
Deixe descansar à temperatura ambiente até que o ágar se solidifique. Para preparar as células de levedura, gire 200 microlitros da cultura de esporulação a 800 G por dois minutos em tubos de microcentrífuga de um mililitro. Descarte 180 microlitros do sobrenadante.
Ressuspeite a pastilha no sobrenadante restante girando e agitando o tubo. Pipetar seis microlitros das células concentradas para a tampa deslizar no meio da câmara no local com. Segure o cilindro com a almofada de ágar e deslize-o cuidadosamente para fora da lâmina de vidro.
Certifique-se de que o ágar esteja completamente plano na parte inferior e, usando a parte inferior da ponta da pipeta, aplique uma pequena quantidade de pressão no molde da microcentrífuga, de modo que a almofada de ágar seja empurrada ligeiramente acima do limite do tubo. Em seguida, inverta o molde de tal forma que a almofada de ágar esteja voltada para baixo em direção à câmara. Use fórceps para colocar suavemente a almofada de ágar no topo das células e a ponta da pipeta para deslizar suavemente a almofada de ágar ao redor da câmara 10 a 20 vezes para criar uma monocamada de células no deslizamento da tampa.
Mantenha a almofada de ágar na câmara por 12 a 15 minutos. Em seguida, transfira dois mililitros de cultura de esporulação para dois tubos de microcentrífuga e gire a 15.700 G por dois minutos. Depois de transferir o sobrenadante para tubos de microcentrífuga limpos, gire novamente na mesma condição e colete o sobrenadante para limpar os tubos de microcentrífuga.
Adicione dois mililitros do sobrenadante gota a gota à câmara que contém a almofada de ágar. Uma vez que o líquido tenha atingido o topo da câmara, a almofada de ágar provavelmente flutuará. Remova a almofada de ágar suavemente com pinça e descarte-a.
Coloque uma tampa de 24 por 50 milímetros na parte superior da câmara para evitar a evaporação durante a imagem. Para configurar o filme no microscópio, encaixe a tampa dentro do suporte da lâmina. Cole a argila de moldagem ao lado da tampa para mantê-la segura no suporte da corrediça.
Abra o software de aquisição de imagens. Use botões de ajuste grossos e finos para focar as células usando DIC ou campo brilhante. No menu principal do software de aquisição de imagens, clique em Arquivo, selecione Adquirir e quatro janelas aparecerão.
Na janela denominada Resolve 3D, clique no ícone do frasco de Erlenmeyer. Isso abrirá uma janela intitulada Design Run Experiment, que contém os controles para configurar um experimento para configurar um filme de lapso de tempo. Na guia Design, navegue até a guia Seccionamento.
Selecione a caixa ao lado de Seção Z e defina o espaçamento de seção óptica para um micrômetro e o número de seções ópticas para cinco. Em seguida, na guia Canais, clique no ícone de adição e selecione o canal apropriado. Em seguida, selecione a caixa ao lado de Imagem de referência e defina a posição Z para o meio da amostra no menu suspenso.
Selecione um valor de transmitância e tempo de exposição no menu suspenso. Na guia Time-lapse, marque a caixa ao lado de Time-lapse e insira valores para minutos e horas para identificar o intervalo de tempo de aquisição de imagem. Marque a caixa ao lado de Manter o foco com foco final para evitar desvios de palco durante o filme.
E na guia Pontos, marque a caixa ao lado de Visitar Lista de Pontos. No menu principal, clique em Exibir e selecione Lista de pontos. Mova o palco para uma área da câmara que mostre uma monocamada de células.
Clique em Marcar ponto na janela Lista de pontos. Mova o estágio para selecionar de 25 a 30 pontos sem qualquer sobreposição para evitar a superexposição das células e da imagem de cada campo durante cada curso de tempo. Na janela Lista de pontos, selecione Calibrar tudo para definir o foco final para cada ponto.
Na guia Executar, salve o arquivo no destino apropriado no computador. Na janela Executar experimento, selecione o botão Reproduzir para iniciar o filme. Abra o software Fiji.
Abra os canais DIC e mCherry. Obtenha uma única projeção de intensidade máxima do canal mCherry clicando em Imagem, seguido por Pilhas e Projeto Z e selecione Intensidade Máxima no menu suspenso. Para mesclar os canais DIC e mCherry em uma imagem, clique em Imagem, Cor e selecione Mesclar canais.
Siga uma única célula através da meiose. Após a conclusão da meiose II, registre o número de massas de DNA. Em células do tipo selvagem com o fundo de âncora afastada, há tipicamente quatro massas de DNA no final da meiose II, representando os quatro produtos da meiose.
Em uma pequena fração das células, apenas três massas são visíveis após a meiose II.Quando o Ctf19-FRB é ancorado no momento da liberação da prófase I, aproximadamente 47% das células exibem mais de quatro massas de DNA após a conclusão da meiose, sugerindo um defeito na fixação de cinetocoros e microtúbulos. Com a ancoragem de Ctf19-FRB, após a montagem do cinetócoro, mas antes da meiose I, ou após a meiose II, aproximadamente 16% das células exibem massas de DNA adicionais. Uma das partes mais importantes deste protocolo é adicionar o sobrenadante dropwise à sua câmara para evitar interromper sua monocamada.
Além disso, observe o tempo necessário para se preparar para a geração de imagens para considerá-la em sua análise. Ao alterar proteínas fluorescentes, este procedimento pode ser usado para responder às perguntas sobre a duração do ciclo celular, segregação cromossômica, abundância de proteínas e localização de proteínas.
