Al sincronizar las células en la profase uno y luego agotar la proteína diana en una etapa particular, este método puede identificar temporalmente funciones distintas de proteínas específicas. El agotamiento condicional de proteínas en etapas específicas de la miosis evita los efectos residuales que un mutante miótico tradicional puede tener en etapas posteriores. Este método podría usarse para estudiar la mitosis de levaduras en ciernes y otros organismos que no sufren la descomposición de la envoltura nuclear.
Además, este método se puede utilizar en otros organismos para estudiar eventos del ciclo celular antes de la descomposición de la envoltura nuclear. Para comenzar, haga una almohadilla de agar que se utilizará para crear una monocapa de células para obtener imágenes. Corte y deseche la tapa y el fondo de un tercio de un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros para crear un cilindro que servirá como molde para la almohadilla de agar.
Coloque el cilindro del tubo de microcentrífuga cortado en un portaobjetos de vidrio limpio con la parte superior del tubo boca abajo, sentado en el portaobjetos. Haga seis mililitros de una solución de agar al 5% en un vaso de precipitados de 50 mililitros. Corte la punta de la pipeta para hacer una abertura más grande y pipete aproximadamente 500 microlitros de agar fundido en el tubo de microcentrífuga.
Déjalo reposar a temperatura ambiente hasta que el agar se solidifique. Para preparar las células de levadura, gire 200 microlitros del cultivo de esporulación a 800 G durante dos minutos en tubos de microcentrífuga de un mililitro. Deseche 180 microlitros del sobrenadante.
Vuelva a suspender el pellet en el sobrenadante restante girando y moviendo el tubo. Pipetear seis microlitros de las células concentradas en el cubreobjetos en el centro de la cámara en el lugar con ConA. Sostenga el cilindro con la almohadilla de agar y deslícelo con cuidado fuera del portaobjetos de vidrio.
Asegúrese de que el agar esté completamente plano en la parte inferior y, utilizando la parte inferior de la punta de la pipeta, aplique una ligera cantidad de presión al molde de microcentrífuga de modo que la almohadilla de agar se empuje ligeramente por encima del límite del tubo. A continuación, invierta el molde de tal manera que la almohadilla de agar esté mirando hacia abajo hacia la cámara. Use pinzas para colocar suavemente la almohadilla de agar en la parte superior de las celdas y la punta de la pipeta para deslizar suavemente la almohadilla de agar alrededor de la cámara de 10 a 20 veces para crear una monocapa de células en el cubreobjetos.
Mantenga la almohadilla de agar en la cámara durante 12 a 15 minutos. A continuación, transfiera dos mililitros de cultivo de esporulación a dos tubos de microcentrífuga y gire a 15, 700 G durante dos minutos. Después de transferir el sobrenadante a tubos de microcentrífuga limpios, gire nuevamente en la misma condición y recoja el sobrenadante para limpiar los tubos de microcentrífuga.
Agregue dos mililitros del sobrenadante gota a gota a la cámara que contiene la almohadilla de agar. Una vez que el líquido ha alcanzado la parte superior de la cámara, lo más probable es que la almohadilla de agar flote. Retire la almohadilla de agar suavemente con fórceps y deséchela.
Coloque un deslizamiento de cubierta de 24 por 50 milímetros en la parte superior de la cámara para evitar la evaporación durante la obtención de imágenes. Para configurar la película en el microscopio, coloque el cubreobjetos dentro del portaobjetos. Adhiera la arcilla de moldeo al lado del deslizamiento de la cubierta para mantenerla segura en el soporte de la corredera.
Abra el software de adquisición de imágenes. Use perillas de ajuste gruesas y finas para enfocar las celdas usando DIC o campo brillante. En el menú principal del software de adquisición de imágenes, haga clic en Archivo, seleccione Adquirir y aparecerán cuatro ventanas.
En la ventana llamada Resolve 3D, haga clic en el icono del matraz Erlenmeyer. Esto abrirá una ventana titulada Design Run Experiment, que contiene los controles para configurar un experimento para configurar una película de lapso de tiempo. En la pestaña Diseño, navegue hasta la pestaña etiquetada Secciones.
Seleccione la casilla situada junto a Sección Z y establezca el espaciado de la sección óptica en un micrómetro y el número de secciones ópticas en cinco. A continuación, en la pestaña Canales, haga clic en el icono más y seleccione el canal apropiado. Luego, seleccione la casilla junto a Imagen de referencia y establezca la posición Z en el centro de la muestra en el menú desplegable.
Seleccione un valor de transmitancia y tiempo de exposición en el menú desplegable. En la pestaña Time-lapse, seleccione la casilla junto a Time-lapse e introduzca valores para minutos y horas para identificar el intervalo de tiempo de adquisición de imágenes. Selecciona la casilla situada junto a Mantener el enfoque con Ultimate Focus para evitar la desviación del escenario durante la película.
Y en la pestaña Puntos, seleccione la casilla junto a Lista de puntos de visita. En el menú principal, haga clic en Ver y seleccione Lista de puntos. Mueva el escenario a un área de la cámara que muestre una monocapa de celdas.
Haga clic en Marcar punto en la ventana Lista de puntos. Mueva el escenario para seleccionar de 25 a 30 puntos sin ninguna superposición para evitar sobreexponer las celdas y crear una imagen de cada campo durante cada curso de tiempo. En la ventana Lista de puntos, seleccione Calibrar todo para establecer el enfoque definitivo para cada punto.
En la pestaña Ejecutar, guarde el archivo en el destino apropiado en el equipo. En la ventana Ejecutar experimento, seleccione el botón Reproducir para iniciar la película. Abra el software Fiji.
Abra los canales DIC y mCherry. Obtenga una única proyección de intensidad máxima del canal mCherry haciendo clic en Imagen, seguido de Pilas y Proyecto Z y seleccione Intensidad máxima en el menú desplegable. Para combinar los canales DIC y mCherry en una sola imagen, haga clic en Imagen, Color y seleccione Combinar canales.
Siga una sola célula a través de la meiosis. Después de completar la meiosis II, registre el número de masas de ADN. En las células de tipo salvaje con el fondo de anclaje, hay típicamente cuatro masas de ADN al final de la meiosis II, que representan los cuatro productos de la meiosis.
Cuando Ctf19-FRB se ancla en el momento de la liberación de la profase I, aproximadamente el 47% de las células muestran más de cuatro masas de ADN al finalizar la meiosis, lo que sugiere un defecto en la unión de cinetocoros y microtúbulos. Con el anclaje de Ctf19-FRB, ya sea después del ensamblaje del cinetocoro pero antes de la meiosis I, o después de la meiosis II, aproximadamente el 16% de las células muestran masas de ADN adicionales. Una de las partes más importantes de este protocolo es agregar el sobrenadante gota a gota a su cámara para evitar interrumpir su monocapa.
Además, tenga en cuenta el tiempo requerido para prepararse para las imágenes para considerarlo en su análisis. Al cambiar las proteínas empaquetadas con fluorescencia, este procedimiento se puede utilizar para responder a las preguntas sobre la duración del ciclo celular, la segregación cromosómica, la abundancia de proteínas y la localización de proteínas.
