En synchronisant les cellules dans la prophase un, puis en épuisant la protéine cible à un stade particulier, cette méthode peut identifier des fonctions temporairement distinctes de protéines spécifiques. L’épuisement conditionnel des protéines à des stades spécifiques de la myose empêche les effets résiduels qu’un mutant myotique traditionnel peut avoir sur les stades ultérieurs. Cette méthode pourrait être utilisée pour étudier la mitose de levure bourgeonnante et d’autres organismes qui ne subissent pas de dégradation de l’enveloppe nucléaire.
En outre, cette méthode peut être utilisée dans d’autres organismes pour étudier les événements du cycle cellulaire avant la rupture de l’enveloppe nucléaire. Pour commencer, fabriquez un tampon de gélose qui sera utilisé pour créer une monocouche de cellules pour l’imagerie. Coupez et jetez le bouchon et le tiers inférieur d’un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre pour créer un cylindre qui servira de moule pour le tampon de gélose.
Placez le cylindre coupé du tube de microcentrifugeuse sur une lame de verre propre avec le haut du tube à l’envers, assis sur la glissière. Fabriquez six millilitres d’une solution de gélose à 5% dans un bécher de 50 millilitres. Coupez l’extrémité de la pipette pour faire une plus grande ouverture et pipette environ 500 microlitres de gélose fondue dans le tube de microcentrifugeuse.
Laisser reposer à température ambiante jusqu’à ce que la gélose se solidifie. Pour préparer les cellules de levure, faites tourner 200 microlitres de la culture de sporulation à 800 G pendant deux minutes dans des tubes microcentrifugés d’un millilitre. Jetez 180 microlitres du surnageant.
Remettez en suspension la pastille dans le surnageant restant en remuant et en agitant le tube. Pipeter six microlitres des cellules concentrées sur le couvercle glissant au milieu de la chambre sur place avec ConA. Tenez le cylindre avec le tampon de gélose et faites-le glisser délicatement hors de la lame de verre.
Assurez-vous que la gélose est complètement plate en bas et, à l’aide du bas de l’embout de la pipette, appliquez une légère pression sur le moule de microcentrifugeuse de sorte que le tampon de gélose soit poussé légèrement au-dessus de la limite du tube. Ensuite, inversez le moule de telle sorte que le tampon de gélose soit orienté vers le bas vers la chambre. Utilisez une pince pour placer doucement le tampon de gélose sur le dessus des cellules et l’embout de la pipette pour faire glisser doucement le tampon de gélose autour de la chambre 10 à 20 fois pour créer une monocouche de cellules sur le couvercle.
Gardez le tampon de gélose dans la chambre pendant 12 à 15 minutes. Ensuite, transférez deux millilitres de culture de sporulation dans deux tubes microcentrifuges et faites tourner à 15, 700 G pendant deux minutes. Après avoir transféré le surnageant dans des tubes à microcentrifugeuses propres, tourner à nouveau dans le même état et recueillir le surnageant pour nettoyer les tubes de microcentrifugation.
Ajouter deux millilitres du surnageant goutte à goutte dans la chambre contenant le tampon d’agar. Une fois que le liquide a atteint le sommet de la chambre, le tampon de gélose flottera très probablement. Retirez doucement le tampon de gélose avec une pince et jetez-le.
Placez un couvercle de 24 millimètres sur 50 millimètres sur le dessus de la chambre pour éviter l’évaporation pendant l’imagerie. Pour configurer le film sur le microscope, insérez le couvercle à l’intérieur du support de lame. Collez la pâte à mouler sur le côté de la glissière de couvercle pour la maintenir en sécurité dans le support de glissière.
Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images. Utilisez des boutons de réglage grossiers et fins pour concentrer les cellules à l’aide de DIC ou de champ clair. Dans le menu principal du logiciel d’acquisition d’images, cliquez sur Fichier, sélectionnez Acquérir et quatre fenêtres apparaîtront.
Dans la fenêtre Resolve 3D, cliquez sur l’icône du flacon Erlenmeyer. Cela ouvrira une fenêtre intitulée Design Run Experiment, qui contient les contrôles permettant de configurer une expérience pour configurer un film accéléré. Sous l’onglet Conception, accédez à l’onglet intitulé Sectionnement.
Cochez la case en regard de Découpe Z et définissez l’espacement des sections optiques sur un micromètre et le nombre de sections optiques sur cinq. Ensuite, sous l’onglet Canaux, cliquez sur l’icône plus et sélectionnez le canal approprié. Ensuite, cochez la case en regard de Référence de l’image et définissez la position Z au milieu de l’échantillon dans le menu déroulant.
Sélectionnez une valeur de transmittance et de temps d’exposition dans le menu déroulant. Sous l’onglet Time-lapse, cochez la case en regard de Time-lapse et entrez des valeurs pour minutes et heures afin d’identifier l’intervalle de temps d’acquisition d’image. Cochez la case en regard de Maintenir la mise au point avec la mise au point ultime pour éviter la dérive de la scène pendant le film.
Et sous l’onglet Points, cochez la case en regard de Liste des points de visite. Dans le menu principal, cliquez sur Afficher et sélectionnez Liste de points. Déplacez la scène vers une zone de la chambre qui montre une monocouche de cellules.
Cliquez sur Marquer le point dans la fenêtre Liste des points. Déplacez la scène pour sélectionner 25 à 30 points sans aucun chevauchement pour éviter de surexposer les cellules et d’imager chaque champ au cours de chaque cours de temps. Dans la fenêtre Liste des points, sélectionnez Calibrer tout pour définir la mise au point ultime pour chaque point.
Sous l’onglet Exécuter, enregistrez le fichier à la destination appropriée sur l’ordinateur. Dans la fenêtre Exécuter une expérience, sélectionnez le bouton Lecture pour démarrer le film. Ouvrez le logiciel Fiji.
Ouvrez les canaux DIC et mCherry. Obtenez une seule projection d’intensité maximale du canal mCherry en cliquant sur Image, puis sur Piles et Projet Z et sélectionnez Intensité maximale dans le menu déroulant. Pour fusionner les canaux DIC et mCherry en une seule image, cliquez sur Image, Couleur et sélectionnez Fusionner les canaux.
Suivez une seule cellule à travers la méiose. Après l’achèvement de la méiose II, notez le nombre de masses d’ADN. Dans les cellules de type sauvage avec l’ancrage éloigné, il y a généralement quatre masses d’ADN à la fin de la méiose II, représentant les quatre produits de la méiose.
Dans une petite fraction des cellules, seules trois masses sont visibles après la méiose II.Lorsque Ctf19-FRB est ancré au moment de la libération de la prophase I, environ 47% des cellules présentent plus de quatre masses d’ADN à la fin de la méiose, suggérant un défaut de fixation des kinétochores et des microtubules. Avec l’ancrage loin de Ctf19-FRB, soit après l’assemblage de kinétochore mais avant la méiose I, soit après la méiose II, environ 16% des cellules présentent des masses d’ADN supplémentaires. L’une des parties les plus importantes de ce protocole est d’ajouter le surnageant goutte à goutte à votre chambre pour éviter de perturber votre monocouche.
En outre, notez le temps nécessaire pour se préparer à l’imagerie afin d’en tenir compte dans votre analyse. En changeant les protéines emballées par fluorescence, cette procédure peut être utilisée pour répondre aux questions concernant la durée du cycle cellulaire, la ségrégation chromosomique, l’abondance des protéines et la localisation des protéines.
