prophase 1에서 세포를 동기화 한 다음 특정 단계에서 표적 단백질을 고갈시킴으로써이 방법은 특정 단백질의 일시적으로 구별되는 기능을 식별 할 수 있습니다. 근증의 특정 단계에서 조건부로 고갈되는 단백질은 전통적인 근염 돌연변이가 후기 단계에서 가질 수 있는 잔류 효과를 방지합니다. 이 방법은 신진 효모 유사 분열 및 핵 외피 파괴를 겪지 않는 다른 유기체를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.
또한이 방법은 핵 외피 파괴 전에 세포주기 이벤트를 연구하기 위해 다른 유기체에서 사용할 수 있습니다. 시작하려면 이미징을위한 세포의 단층을 만드는 데 사용할 한천 패드를 만드십시오. 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브의 캡과 바닥 1/3을 잘라내어 폐기하여 한천 패드의 금형 역할을 할 실린더를 만듭니다.
절단된 미세 원심분리기 튜브 실린더를 튜브 상단을 거꾸로 하여 슬라이드에 놓은 깨끗한 유리 슬라이드에 놓습니다. 50밀리리터 비커에 5%한천 용액 6밀리리터를 만듭니다. 피펫의 끝을 잘라 더 큰 구멍을 만들고 약 500 마이크로 리터의 용융 한천을 마이크로 원심 분리 튜브에 피펫팅합니다.
한천이 굳을 때까지 실온에 두십시오. 효모 세포를 준비하려면 1밀리리터 마이크로원심분리 튜브에서 2분 동안 800G에서 200마이크로리터의 포자 형성 배양물을 스핀다운합니다. 180 마이크로 리터의 상청액을 버립니다.
튜브를 소용돌이 치고 튕겨서 나머지 상청액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 농축된 세포를 6 마이크로리터의 커버 슬립 상에 피펫팅하여 ConA와 함께 그 자리에서 챔버의 중앙에서 미끄러진다. 한천 패드로 실린더를 잡고 유리 슬라이드에서 조심스럽게 밀어냅니다.
한천이 바닥에서 완전히 평평한지 확인하고 피펫 팁의 바닥을 사용하여 한천 패드가 튜브 경계보다 약간 위로 밀려 나오도록 미세 원심 분리기 몰드에 약간의 압력을 가합니다. 다음으로, 한천 패드가 챔버를 향하도록 금형을 뒤집습니다. 집게를 사용하여 한천 패드를 세포 위에 부드럽게 놓고 피펫 팁을 사용하여 한천 패드를 챔버 주위로 10-20 회 부드럽게 밀어 커버 슬립에 세포 단층을 만듭니다.
한천 패드를 챔버에 12-15 분 동안 유지하십시오. 다음으로, 2 밀리리터의 포자 형성 배양 물을 2 개의 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고 15, 700 G에서 2 분 동안 회전시킨다. 상청액을 깨끗한 미세 원심 분리 튜브로 옮긴 후 동일한 조건에서 다시 회전하고 상청액을 수집하여 미세 원심 분리 튜브를 청소합니다.
2 밀리리터의 상청액을 한천 패드를 포함하는 챔버에 적가한다. 액체가 챔버의 상단에 도달하면 한천 패드가 떠 있을 가능성이 큽니다. 한천 패드를 집게로 부드럽게 제거하고 버립니다.
이미징 중 증발을 방지하기 위해 챔버 상단에 24 x 50mm 커버 슬립을 놓습니다. 현미경에서 동영상을 설정하려면 슬라이드 홀더 안에 커버 슬립을 맞춥니다. 성형 점토를 커버 슬립 측면에 부착하여 슬라이드 홀더에 단단히 고정하십시오.
이미지 수집 소프트웨어를 엽니다. 거칠고 미세한 조정 손잡이를 사용하여 DIC 또는 명시야를 사용하여 셀의 초점을 맞춥니다. 이미지 수집 소프트웨어의 메인 메뉴에서 파일을 클릭하고 획득을 선택하면 4개의 창이 나타납니다.
Resolve 3D라는 창에서 삼각 플라스크 아이콘을 클릭합니다. 그러면 타임랩스 동영상을 설정하기 위한 실험을 설정하기 위한 컨트롤이 포함된 디자인 실행 실험이라는 창이 열립니다. 디자인 탭에서 단면화라는 레이블이 지정된 탭으로 이동합니다.
Z 단면 옆에 있는 상자를 선택하고 광학 단면 간격을 1마이크로미터로, 광학 단면 수를 5로 설정합니다. 그런 다음 채널 탭에서 더하기 아이콘을 클릭하고 적절한 채널을 선택합니다. 그런 다음 참조 이미지 옆의 상자를 선택하고 드롭다운 메뉴에서 Z 위치를 샘플 중간으로 설정합니다.
드롭다운 메뉴에서 투과율 및 노출 시간 값을 선택합니다. 타임랩스 탭에서 타임랩스 옆의 상자를 선택하고 분 및 시간 값을 입력하여 이미지 획득 시간 간격을 식별합니다. 궁극의 초점으로 초점 유지 옆에 있는 상자를 선택하여 동영상 중에 스테이지 드리프트를 방지합니다.
그리고 포인트 탭에서 방문 포인트 리스트 옆에 있는 상자를 선택합니다. 메인 메뉴에서 보기를 클릭하고 포인트 리스트를 선택합니다. 스테이지를 셀의 단층을 보여주는 챔버 영역으로 이동합니다.
점 리스트 창에서 점 표시를 클릭합니다. 스테이지를 이동하여 겹치지 않고 25-30 개의 포인트를 선택하여 각 시간 코스 동안 셀과 각 필드를 이미지화하지 않도록하십시오. 점 리스트 창에서 모두 보정을 선택하여 각 점에 대한 최종 초점을 설정합니다.
실행 탭에서 파일을 컴퓨터의 적절한 대상에 저장합니다. 실험 실행 창에서 재생 단추를 선택하여 동영상을 시작합니다. 피지 소프트웨어를 엽니다.
DIC 및 m체리 채널을 엽니다. 이미지를 클릭한 다음 스택 및 Z 프로젝트를 클릭하여 mCherry 채널의 단일 최대 강도 투영을 얻고 드롭다운 메뉴에서 최대 강도를 선택합니다. DIC 및 mCherry 채널을 하나의 이미지로 병합하려면 이미지, 색상을 클릭하고 채널 병합을 선택합니다.
감수 분열을 통해 단일 세포를 따르십시오. 감수 분열 II 완료 후, DNA 질량의 수를 기록한다. 닻이 떨어져 있는 배경이 있는 야생형 세포에서는 감수 분열 II의 끝에 일반적으로 감수 분열의 4가지 생성물을 나타내는 4개의 DNA 덩어리가 있습니다.
세포의 작은 부분에서, 감수 분열 II 후에 단지 3 개의 질량이 보인다.Ctf19-FRB가 prophase I의 방출 시점에 멀리 고정되면, 약 47 %감수 분열의 완료시 세포의 4 개 이상의 DNA 덩어리를 나타내며, 이는 키네 토코 레스와 미세 소관의 부착에 결함이 있음을 시사한다. 키네토코어 조립 후 감수 분열 I 이전 또는 감수 분열 II 후에 Ctf19-FRB를 고정하면 약 16%의 세포가 추가 DNA 덩어리를 나타냅니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 부분 중 하나는 단층이 파괴되지 않도록 상청액을 챔버에 적가하는 것입니다.
또한 분석에서 이미징을 고려하기 위해 이미징을 준비하는 데 필요한 시간을 기록해 둡니다. 형광으로 채워진 단백질을 변경함으로써이 절차는 세포주기 기간, 염색체 분리, 단백질 풍부도 및 단백질 국소화에 관한 질문에 답하는 데 사용될 수 있습니다.
