Органотипические срезы тканей были получены из различных тканей. Благодаря сохраненной целостности тканей и развитию методик культивирования, они оказались пригодными для моделирования сложных физиологических механизмов. Органотипические культуры срезов из карцином поджелудочной железы тщательно пересчитывают многоклеточную архитектуру опухоли и ее микроокружение ex vivo.
Они могут использоваться для различных последующих задач, таких как тестирование реакции на лекарственные препараты. Они могут быть культивированы сразу после хирургической резекции опухоли, они недороги и менее трудоемки по сравнению с большинством других методов первичного культивирования. Демонстрировать процедуру будет Ольга Лапшина, технический ассистент из Университета Любека.
Для начала приготовьте 100 миллилитров легкоплавкой 8%-ной агарозы, растворив восемь граммов агарозы в 100 миллилитрах предварительно подогретого раствора Рингера, и храните его при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока он не понадобится. После объявления о резекции опухоли растопите агарозу в микроволновой печи. Поместите агарозу на предварительно разогретую водяную баню, дав ей остыть до физиологической температуры перед приготовлением.
Поместите лезвие бритвы в держатель вибратома и выполните автоматическую регулировку угла наклона в соответствии с инструкциями производителя. Охладите рубашку режущей камеры с помощью охлаждающего агрегата или влажного льда. Заполните режущую камеру примерно 100 миллилитрами раствора для кольцевания, затем поместите установленное лезвие бритвы в предварительно охлажденный раствор для резки, дав лезвию бритвы остыть.
Промойте образец ткани охлажденным PBS и поместите его в большую 14-сантиметровую чашку Петри на льду. Удалите макроскопически видимые излишки соединительной ткани на льду с помощью скальпеля. Поместите салфетку в небольшую чашку Петри.
Отрегулируйте ориентацию тканей таким образом, чтобы оставшаяся макроскопически видимая соединительная ткань имела ту же ориентацию, что и плоскость дна чашки Петри. В маленькую чашку Петри вылейте подготовленную легкоплавкую агарозу, регулируя ориентацию ткани. При необходимости, с помощью щипцов, поместите чашку Петри на влажный лед для более быстрого застывания агарозы.
Аккуратно разрежьте ткань с помощью скальпеля, оставив не менее пяти миллиметров окружающей агарозы с каждой стороны ткани. Добавьте клей в держатель для образцов, распределите его, а затем перенесите внедренную ткань и приклейте ее на держатель для образцов с помощью суперклея. Через несколько секунд поместите держатель для образцов в режущую камеру и при необходимости отрегулируйте ориентацию ткани по отношению к лезвию бритвы.
Определите внешние границы диапазона резки в соответствии с размером образца ткани. Отрегулируйте лезвие по направлению к верхней части тканевого блока. Установите скорость резки на 0,04 миллиметра в секунду, амплитуду резки на один миллиметр и толщину среза на 300 микрометров.
Аккуратно нарежьте первые ломтики и переложите ломтики в отдельную емкость с предварительно охлажденным раствором кольца на мокрый лед. Приготовьте шестилуночную тарелку с одним миллилитром соответствующей среды для выращивания на лунку. Поместите шестилуночный планшет со средой в инкубатор, позволив отрегулировать температуру и pH перед культивированием.
Поместите срезы на вставки для клеточных культур с помощью фильтра для взгляда, затем удалите излишки раствора Ringer, поместив загруженный фильтр на стерильную ткань. Поместите загруженный фильтр в подготовленную шестилуночную пластину без добавления дополнительной среды во вкладыш, затем поместите шестилуночную пластину в инкубатор и меняйте среду каждые два дня. Поместите фильтр для выращивания с установленным ломтиком на чашку Петри.
Скальпелем аккуратно вырезаем фильтрующую мембрану с вмонтированным срезом ткани. Перенесите фильтрующую мембрану с установленным срезом в нейлоновый мешок для биопсии и поместите его в встраиваемую кассету. Затем переложите пластиковые закладные кассеты в контейнер с предварительно охлажденным 4,5%-ным формалином минимум на 24 часа или до дальнейшего использования.
Осторожно промойте фиксированный формалин культуры проточной водой из-под крана в течение 1,5 часов. Обезвоживайте фиксированный срез ткани формалина путем инкубации в 70% 95% и абсолютный этанол. Затем очистите фиксированный формалин от неподвижного среза ткани с помощью двух трехчасовых инкубаций в ксилоле.
Погрузите ткань с парафином при температуре 60 градусов Цельсия на ночь, а затем еще раз на два часа. Поместите ткань в парафиновый блок в форму для заделки ткани и поместите ее на лед, чтобы быстрее охладить образец. Разрез залитого парафином тканевого блока на толщину четыре микрометра с помощью микротома и в водяной бане с температурой 40 градусов Цельсия, содержащей дистиллированную воду.
Перенесите срезы на стеклянные предметные стекла. Инкубируйте парафиновые срезы в течение часа при температуре 60 градусов Цельсия, чтобы приклеить ткань к стеклу. Затем инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию.
Депарафинизируйте срезы путем инкубации в ксилоле три раза по пять минут каждый. Затем регидратируйте путем последовательной инкубации в абсолютном спирте, 95% алкоголя и 70% алкоголя. Запачкайте срезы раствором гематоксилина по Майеру на пять минут и промойте проточной водой из-под крана в течение 10 минут.
Окрасить в 0,5% раствор ESN в течение 40 секунд и смыть дистиллированной водой, затем повторить обезвоживание в этаноле. Очистите ткань в трех сменах ксилола в течение нескольких секунд каждая, затем поместите каплю монтажного средства и накройте предметные стекла покровным листом. Макроскопическая морфология каждого OTSC снижалась во время культивирования в течение шести дней.
Сохраненная жизнеспособность OTSC из двух репрезентативных первичных опухолей в двух разных средах показала снижение жизнеспособности после нулевого дня из-за процедуры секционирования и адаптации к условиям культивирования, а также увеличение жизнеспособности образца опухоли в правой панели. Срезы окрашивания H&E показали, что общая структура ткани сохранялась в течение всего времени культивирования ex vivo, и что не было обнаружено никаких грубых изменений пролиферации и апоптоза в течение периода культивирования в шесть дней. Микроскопическая гистопатологическая оценка срезов H&E не выявила существенного увеличения некроза всех культивируемых тканей во время культивирования.
Наблюдалось увеличение расщепленных каспаз-3-положительных клеток после культивирования первичной протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, или PDAC, в течение 15 дней. Гистопатология перитонеального метастаза PDAC продемонстрировала высокую внутриопухолевую гетерогенность между отдельными срезами, а также естественный апоптоз, измеряемый окрашиванием расщепленными каспазами-3. Окрашивание H&E и иммуногистологическая характеристика цитокератина 7 при метастазировании PDAC брюшной стенки показали, что полученные OTSC не содержали опухолевых клеток, а состояли только из соединительной ткани, которая была частично некротической.
Каждый культивируемый срез может быть профилирован индивидуально, в зависимости от конкретного исследовательского вопроса, например, с помощью секвенирования РНК для транскриптомики или мягкой визуализации для пространственно разрешенной протеомики. В перспективе комбинация с неразрушающими аналитическими методами имеет большой потенциал для прогнозирования специфических для пациента реакций на различные терапевтические режимы.
